【抗大腸癌1】牛樟芝三萜類毒殺大腸癌細胞與作用機制 Cytotoxic triterpenes from Antrodia camphorata and mode of action in human colon cancer cells

論文發表在美國期刊: Cancer Letters (美國癌症期刊)

衛福部國健署2017/12/28公布最新癌症統計報告(統計至2015年)。2015年癌症新發人數為10.5萬人，較前一年增加2009人，每10萬人就有302人罹癌，平均每5分鐘就有1人罹癌。
2015年國人發生人數最多，前十名癌症與2014年相同，排行榜依序為大腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、口腔癌（含口咽、下咽）、攝護腺癌、胃癌、皮膚癌、甲狀腺癌、食道癌。
由性別來看，男性口腔癌與食道癌症發生，為女性的11.6倍與15.8倍，男性癌患發前5名為大腸癌(Colon Cancer)、肝癌(Hepatoma)、肺癌(Lung Cancer)、口腔癌、攝護腺癌；女性則為乳癌(Breast Cancer)、大腸癌(Colon Cancer)、肺癌(Lung Cancer)、肝癌(Hepatoma)及甲狀腺癌(Thyroid Cancer)。

大腸癌十度蟬聯十大癌症發生人數首位!!

一直以來，牛樟芝在抗癌研究上吸引很多學者投入研究，大腸癌當然也不例外! 本篇研究由台灣國家健康研究院+台北醫學大學+加拿大國家研究委員會(生技研究所)共同研究，牛樟芝三萜類的複合物在毒殺大腸癌細胞的效果顯著，並獲美國癌症期刊選用(Cancer Letters)。
National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes, Taiwan
Cancer Center, Wan Fang Hospital, Taipei Medical University, Taiwan
Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada, Montreal, Quebec, Canada

延伸閱讀 >> 牛樟芝最新年度推薦

1.摘要

牛樟芝生長於死亡牛樟樹的木質部，已被華人當作中藥並廣泛用於食物/藥物中毒，腹瀉，腹痛，高血壓和癌症等。牛樟芝富含三萜類，三萜類是抗癌的主要活性成分，牛樟三萜類種類超過200種以上，釐清不同三萜與抗癌的效果，一直是學者研究的重點。

本研究從牛樟芝純化出8種複合物，包括5種羊毛固醇 lanostane (2,3,4,6,8)與3種麥角固醇 ergostane (1,5,7)，透過體外實驗去評估不同複合物對不同種類癌細胞的毒殺(細胞毒性: cytotoxic)效果。

透過IC₅₀評估，三萜複合物1,5,7毒殺癌細胞效果最好，8種複合物對人類正常細胞mammary epithelial (人類乳腺上皮細胞)與foreskin fibroblast(人類皮膚纖維母細胞)均無毒性。

三萜複合物1,5,7展現出可造成大腸癌細胞(HT-29, SW-480)死亡(凋亡Apoptosis)；也確認能在sub-G1階段阻止癌細胞複製。

三萜複合物1,5,7可阻斷sub-G1階段的癌細胞複製，並透過裂解PARP(DNA修復酶)、Bcl-2(抗凋亡蛋白)與 procaspase-3(未活化凋亡蛋白)來造成癌細胞凋亡。此外，三萜複合物1,5,7的混合物質，表現出具潛力的協同毒殺大腸癌細胞(HT-29)的作用。

三萜複合物1,5,7各4 μM的混合物質，在毒殺大腸癌細胞(HT-29)表現出最好的效果。

2.前言

癌症在全球造成很多病患死亡也對生活帶來很多問題，包括: 生理與心理的痛苦也造成了經濟上莫大的壓力。因此，醫界一直努力希望能在癌症治療上有所突破，雖已開發出相關的抗癌製劑，然而無可避免的，抗癌製劑也帶來了許多問題，像副作用與抗藥性。

為了解決這些困難，開發癌症預防製劑 (cancer chemopreventive agents ) 與改善癌症治療方法( cancer treatment)就顯得相當重要。從純自然的天然植物中找出具潛力的抗癌製品來當作營養補充就顯得相當重要。

天然的三萜類(Triterpenoids)具有多種藥理特性，引起研究團隊的興趣，並從牛樟芝純化出8種三萜類複合物，包括5種羊毛固醇(2,3,4,6,8)與3種麥角固醇(1,5,7)，展開體外實驗。

從研究結果中顯示，8種三萜類複合物在體外實驗中，可有效毒殺大腸癌、肝癌、乳癌與肺癌細胞，見圖1。

延伸閱讀 >> 牛樟芝最新年度推薦

3.研究結果與討論

3.1細胞複製研究

使用10種不同癌細胞與2種正常細胞進行體外實驗，並與8種三萜類複合物進行細胞複製實驗，經48小時候透過sulforhodamine B assay (SRB)比色法來檢測癌細胞增殖。

三萜複合物1,5,7對應不同癌細胞，表現出較廣泛的毒殺效果，IC₅₀的數值分布在22.3~75.0μM (表1)。實驗發現當IC₅₀ < 30μM在抗癌將有最高的效力。其中三萜複合物1又較三萜複合物5,7更有效果，包括大腸癌細胞(HT-29, SW-480)、肝癌細胞(Huh-7, Hep G2)、乳癌細胞(MDA-MB-231)與肺癌細胞(A-549)的 IC₅₀ < 30μM。

三萜複合物1對Hep G2肝癌細胞展現出較強的成長抑制性(IC₅₀ = 23.4 μM)，對Hep 3B肝癌細胞則呈現中度的成長抑制性(IC₅₀ = 68.3 μM)。三萜複合物1對MDA-MB-231乳癌細胞展現出較強的成長抑制性(IC₅₀ = 25.1 μM)，對MCF-7乳癌細胞則呈現中度的成長抑制性(IC₅₀ = 57.8 μM)。

三萜複合物1對所有癌細胞的抑制性都相當明顯。三萜複合物5在肺癌與肝癌細胞上就稍不如三萜複合物1。三萜複合物7在大腸癌細胞的抑制表現較顯著。

8種複合物對人類正常細胞無抑制性或不顯著，包括 MCF10A人類乳腺上皮細胞(mammary epithelial)與 HS68人類皮膚纖維母細胞 (foreskin fibroblast)。

三萜複合物2,3,4,6,8在不同癌細胞的表現上出現較大差異性。三萜複合物3在大腸癌細胞較具毒殺性，在抗HT-29, HCT-116與SW-480癌細胞上，對應IC₅₀的數值為59.8, 79.9 與 86.5μM；三萜複合物3在抗肺癌細胞(A-549, CL1-0)上則不明顯(IC ₅₀ > 500 μM)。

3.2人類大腸癌細胞的細胞週期阻滯和凋亡

研究為了觀察到細胞毒性作用是否是造成癌細胞凋亡，將三萜複合物1-8施用50μM於HT-29大腸癌細胞，經培養細胞48小時，檢測HT29細胞中的sub-G1積累的凋亡癌細胞數量比。通過流式細胞分析檢查細胞週期（sub-G1）。

與控制組凋亡比例0.77%相較，三萜複合物1,5,7造成HT29大腸癌細胞在sub-G1階段的凋亡比例分別為41.7%, 32.7% 與29.5%，三萜複合物1,5,7顯著造成HT29大腸癌細胞凋亡 (圖2)。

三萜複合物1,5,7接著以25-100μM不同濃度，經培養細胞48小時，來測試抗大腸癌細胞(HT-29, SW480)效果。測試結果顯示出三萜複合物1,5,7可以造成大腸癌細胞凋亡(死亡)，且有劑量相關性(濃度越高效果越好)，見圖3。與表1的癌細胞毒殺結果相互呼應。

從圖3可以發現三萜複合物1隨著濃度增加，造成大腸癌細胞(HT-29, SW480)的凋亡比例越高，在濃度100μM時凋亡率分別為HT-29: 37.76% 與 SW480: 30.70% (圖3 紅框所示)。同樣，三萜複合物5,7也有相同趨勢，在濃度100μM時SW480凋亡率分別為三萜複合物5: 23.8% 與三萜複合物7: 27.8%。

3.3 PARP，Bcl-2和pro-caspase-3對HT-29癌細胞造成的結果

細胞凋亡是有順序的過程，其中發生多種事件，包括關鍵調節分子的後轉譯修飾，例如蛋白激酶、Bcl-2家族(抗凋亡蛋白酶)和caspases(促凋亡蛋白酶)。三萜類能引發癌細胞凋亡並造成癌細胞複製週期停滯。本研究安排相關實驗去驗證三萜複合物1~8,造成HT-29癌細胞凋亡的能力，並透過西方墨點分析法進行分析。

使用三萜複合物1,5,7，會使PARP(DNA修復酶)裂解升高，見圖4。更具體地說，在使用三萜複合物1,5,7經48小時後細胞核中PARP的裂解形式顯著增加，而核全長的PARP則減少(圖4)。在Bcl-2(抗凋亡蛋白)與 procaspase-3(未活化凋亡蛋白)的表現也發現類似的抑制效果。在細胞凋亡過程中，PARP被活性caspase-3直接蛋白水解，導致PARP失去活性無法對DNA進行修復(即無法修復癌細胞)。

三萜複合物1,5,7可阻斷sub-G1階段的癌細胞複製，並透過裂解PARP(DNA修復酶)、Bcl-2(抗凋亡蛋白)與 procaspase-3(未活化凋亡蛋白)來造成癌細胞凋亡。

三萜複合物1,5,7在本研究中持續一至性的表現出透過粒線體有關的路徑介導，可造成HT-29癌細胞凋亡，見圖3與圖4。

3.4三萜複合物綜合治療在大腸癌細胞的成長抑制性

接下來針對HT-29大腸癌細胞，以三萜複合物1,5,7進行癌細胞毒殺試驗，分為: (1)單一三萜複合物1,5,7搭配不同濃度 (6,12 μM)；(2)混合三萜複合物1,5,7 (4,6 μM)，進行SRB assay檢測分析，見圖5。

如圖5所示，混合三萜複合物1,5,7時，各複合物單一劑量最低時(4 μM)對HT-29大腸癌細胞的達到最大抑制能力。

如圖5，三萜複合物1,5,7各自單一使用時，不論濃度是6或12 μM，癌細胞活性普遍高於混合三萜複合物1,5,7使用。混合使用分為1+5、1+7、5+7 (混合2種)與1+5+7 (混合3種)，可以發現混合2種三萜複合物的癌細胞活性普遍比使用單一三萜複合物來的低，癌細胞活性被抑制率分別為1+5: 67.1%、1+7: 63.7%、5+7: 47.0% (圖5 藍框所示)。而混合3種三萜複合物的癌細胞抑制能力最強，所以癌細胞活性最低，癌細胞活性被抑制率達85.6% (圖5 紅框所示)。

4.結論

結論，本研究已經證明來自牛樟芝的三萜類能抑制大腸癌，肝癌，乳腺癌和肺癌細胞系中的細胞增殖。

三萜複合物也阻止了sub-G1階段的細胞週期的進展;另外，透過下游PARP，pro-caspase-3和Bcl-2的裂解，造成大腸癌細胞凋亡。

此外，三萜複合物混合使用在HT-29細胞中表現出有效的協同毒殺癌細胞作用。值得進一步研究以確定體內抗腫瘤活性並闡明其潛在的作用機制。

【註】本研究受國家科學委員會(台灣)和國家衛生研究院(台灣)的資助。

延伸閱讀 >> 牛樟芝最新年度推薦

NiuChangChih牛樟芝功效 (pharmacological effects of Antrodia cinnamomea)：

保護肝臟(hepato-protective)、解酒(anti-hangover)、抗癌(anti-cancer)、抗過敏(anti-allergenic)、增強免疫力(strengthen immune system)、降高血壓(antihypertensive)、降高脂血(antihyperlipemic)、降血糖(anti-diabetic)、免疫調節(immunomodulatory)、抗氧化(anti-oxidant)、抗發炎(anti-inflammatory)

NiuChangChih牛樟芝的主要成份 (bioactive components of Antrodia cinnamomea)：

三萜類（Triterpenoids）、多醣體（Polysaccharides）、腺苷（Adenosine）、超氧歧化酶（SOD）、麥角固醇（Ergosterol）、羊毛固醇（Lanosterol）、免疫蛋白（Immunity Protein）、維生素（Vitamins）、核酸（Nucleic Acid）、胺基酸（Amino Acid）、苯類(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinone derivates )、馬來酸（Maleic acid）琥珀酸（Succinic acid）、凝集素（Lectin）、木質素（Lignin）、血壓穩定物質（Antrodia acid）、礦物質（鈣、磷、鐵、鍺等）