# 牛樟芝科學實證：荷蘭期刊解析牛樟芝萃取物抑制肺腺癌轉移機制 **論文發表在荷蘭期刊: Phytomedicine (植物醫學)** 肺癌是全世界發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，癌細胞轉移是造成病患死亡的首要原因。 癌細胞因增殖快速，需要足夠的營養和氧氣，因此，癌細胞必須侵蝕周圍正常細胞並要求新生血管提供增長所需的養分，更可能經由血液和淋巴系統擴散至其他組織器官，這就是所謂的癌細胞轉移，這是造成罹癌患者的主要征候，也是臨床治療中最難以根治與死亡的主要原因。 本篇為您介紹的牛樟芝研究是中國醫、中國醫附設醫院吳院長領軍與興大、成大共同研究，並獲荷蘭Phytomedicine (植物醫學期刊)選用於2012年發表。研究發現牛樟芝萃取物可抑制MMP-2、MMP-9的活性進而達成抑制肺腺癌細胞轉移，研究接著更進一步從生化機制去證實牛樟芝萃取物藉由MAPK與PI3K/AKT機制抑制癌細胞轉移，學者投入牛樟芝研究已超過十多年，逐步釐清牛樟芝抗癌效果與機制，發表在各領域專業期刊已累積超過300篇。 科普一下甚麼是蛋白酶? 蛋白酶是生物體內的一類酶（酵素），它們能夠分解蛋白質。 那MMP-2與MMP-9又是甚麼? MMP-2與MMP-9同屬於基質金屬蛋白酶(MMP:  Matrix metallopoateinase)家族的一份子。基質金屬蛋白酶 (MMP) 可以分解細胞外基質的結構蛋白，具有型態生成、血管生成、神經生成及細胞修復等組織重塑的能力 ; 但這能力也會促使癌細胞的增殖、轉移、分化、血管新生、及抑制細胞凋亡等作用。也就是說MMP與癌細胞的轉移和侵襲有關系!! MMP(基質金屬蛋白酶)是一個大家族，在這麼多種MMP成員中，屬於明膠酶的MMP-2與MMP-9被認為與癌的轉移及血管生成特別具有相關性，過量表現的MMP-2和MMP-9也會促使癌細胞的生長、血管新生、侵襲及惡化，幫助癌細胞向外擴散。 [maxbutton id="12"] ## **1.研究****摘要：** 癌症轉移是癌症死亡的主要原因，台灣藥用牛樟芝（Antrodia cinnamomea）已被證明具有抗氧化和抗癌活性**。**在本篇研究中，我們首先觀察到在對正常細胞不具有毒性的情況下，牛樟芝子實體的乙醇萃取物（EEAC）對人體肺腺癌CL1-0細胞的轉移和運動性具有濃度依賴性的抑制作用(濃度越高抑制效果越好)。 明膠酶譜測定(gelatin zymography)結果顯示牛樟芝萃取物在抑制MMP-2、MMP-9（基質金屬蛋白酶）的活性上具有濃度依賴性。蛋白質西方點墨法測定(Western blot)的結果顯示，牛樟芝萃取物處理可降低MMP-9和MMP-2的表現。 牛樟芝萃取物（EEAC）裡的兩種主要化合物: 蟲草素(codycepin)和三萜類樟菇酸A(zhankuic acid A)可單獨或共同抑制MMP-9和MMP-2的表現。進一步研究發現，牛樟芝抑制了p38和JNK1/2的磷酸化。 牛樟芝還抑制PI3K的表現和AKT的磷酸化。這是第一份研究證實牛樟芝對人類肺腺癌細胞CL1-0具有抗轉移作用。 ## **2.****結果與討論：** ### **2.1 ****牛樟芝萃取物****(EEAC)****對於人類肺腺癌****CL1-0****癌細胞的毒殺性分析** [caption id="attachment_4225" align="aligncenter" width="1024"][](http://ncc-college.com/wp-content/uploads/2020/10/圖2.png) 圖2牛樟芝萃取物濃度與癌細胞活性分析[/caption] 藉由MTT分析來測定不同濃度EEAC（0–128 μg/ml）對癌細胞活性的影響效果。 經培育24小時和36小時後，與未使用牛樟芝EEAC的控制組相比，低濃度EEAC（0.125–2 μg/ml）對癌細胞活力沒有顯著影響（圖2），這表明EEAC在低濃度下對CL1-0癌細胞無毒。癌細胞在使用高濃度EEAC (4.0–128 μg/ml) 24和36小時後，癌細胞活力出現顯著下降。 為了避免在接下來的實驗中抑制癌細胞活力， EEAC的濃度我們僅使用0.125–1.0 μg/ml區間，培育時間則為36 小時。 ### **2.2 ****牛樟芝萃取物****(EEAC)****對****CL1-0****癌細胞轉移能力的測定****(wound scratch assay)** [caption id="attachment_4226" align="aligncenter" width="1024"][](http://ncc-college.com/wp-content/uploads/2020/10/圖3.png) 圖3牛樟芝萃取物濃度對癌細胞轉移能力的影響[/caption] 使用wound scratch assay分析去評估EEAC對CL1-0癌細胞轉移的影響(圖3A)。培育36小時後，牛樟芝萃取物EEAC以劑量依賴性方式抑制CL1-0癌細胞的轉移能力，濃度0.5μg/ml抑制10.3％轉移力，濃度1.0 μg/ml抑制14.8％轉移能力（圖3B）。 ### **2.3 ****牛樟芝萃取物****(EEAC)****對****CL1-0****癌細胞轉移的影響（體外測試）** [caption id="attachment_4227" align="aligncenter" width="1024"][](http://ncc-college.com/wp-content/uploads/2020/10/圖4.png) 圖4牛樟芝萃取物濃度對癌細胞轉移能力的影響(體外測試)[/caption] 使用Transwell測定法來分析CL1-0癌細胞在使用了EEAC 24小時後的轉移情況。研究發現添加0.25–1.0 μg/ml 牛樟芝EEAC可顯著降低CL1-0癌細胞的23%轉移力（圖4A,4B），且EEAC的抑制效果是具有劑量依賴性的(濃度越高抑制效果越好)。 ### **2.4 ****牛樟芝萃取物****(EEAC)****抑制****CL1-0****細胞中****MMP-2****和****MMP-9****的活性** [caption id="attachment_4228" align="aligncenter" width="669"][](http://ncc-college.com/wp-content/uploads/2020/10/圖5.png) 圖5牛樟芝萃取物濃度對癌細胞活力影響[/caption] 為了檢查EEAC可能的抗轉移機制，我們透過明膠酶譜分析去評估CL1-0癌細胞中MMP-2和MMP-9的活性。 在沒有使用牛樟芝EEAC的情況下，CL1-0癌細胞分泌高程度的MMP-9和MMP-2。 如圖5所示，牛樟芝EEAC以濃度依賴性方式抑制MMP-9和MMP-2活性（圖5A,5B）。 MMP-2和MMP-9被認為會促使癌細胞生長、血管新生、幫助癌細胞向外擴散。研究結果表明，牛樟芝EEAC能抑制MMP-9和MMP-2活性而達成抑制CL1-0肺癌細胞轉移。 ### **2.5 ****牛樟芝萃取物****(EEAC)****對****MMP-2****和****MMP-9****的抑制性** [caption id="attachment_4229" align="aligncenter" width="613"][](http://ncc-college.com/wp-content/uploads/2020/10/圖6.png) 圖6牛樟芝萃取物對癌細胞的抑制性[/caption] 為了檢查牛樟芝EEAC可能的抗轉移機制，我們透過蛋白質西方點墨法分析去評估CL1-0癌細胞中MMP-2和MMP-9的表現。 在沒有EEAC處理的情況下，CL1-0癌細胞有高程度的MMP-9和MMP-2表現。 如圖6A所示，EEAC以濃度依賴性方式抑制MMP-9和MMP-2的表現。 ### **2.6 ****牛樟芝萃取物****(EEAC)****中主成分蟲草素、樟菇酸****A****對****MMP-2****和****MMP-9****抑制性** 牛樟芝萃取物(EEAC)中有兩項主成分: 蟲草素與樟菇酸A。為了檢查蟲草素、樟菇酸A可能的抗轉移機制，我們透過蛋白質西方點墨法分析去評估CL1-0癌細胞中MMP-2和MMP-9的表現。在沒有使用牛樟芝EEAC的情況下，CL1-0細胞表現出高程度的MMP-9和MMP-2。 如圖6B所示，單獨使用蟲草素、樟菇酸A或同時使用蟲草素+樟菇酸，都可抑制MMP-9和MMP-2的表現。 ### **2.7 ****牛樟芝萃取物****(EEAC)****對****CL1-0****癌細胞的****PI3K****、****AKT****、磷酸化****AKT****（****pAKT****）和****Rac-1****表現的影響** [caption id="attachment_4230" align="aligncenter" width="708"][](http://ncc-college.com/wp-content/uploads/2020/10/圖7.png) 圖7牛樟芝萃取物對癌細胞PI3K、AKT、磷酸化AKT（pAKT）和Rac-1的影響性[/caption] PI3K是一組分布甚廣的脂質激酶，在細胞信號傳導的主要途徑中扮演重要作用。 各類型細胞在進行細胞增殖、分化和死亡過程中，PI3K / AKT扮演重要調節功能。 為了進一步研究PI3K / AKT的影響，進行了一系列實驗評估經牛樟芝EEAC刺激後傳訊分子的表現。 結果顯示，CL1-0癌細胞與牛樟芝EEAC（0.125–1.0 μg/ml）培養後，劑量依賴性地導致降低PI3K和pAKT（圖7），進而影響癌細胞信號傳遞。 但是，EEAC（0–1.0μ g/ml，36小時）對Rac-1蛋白表現沒有影響（圖7）。 ### **2.8 ****牛樟芝萃取物****(EEAC)****對****CL1-0****癌細胞的****FAK, ERK1/2, p38 ****和**** JNK1/2****磷酸化表現的影響** [caption id="attachment_4231" align="aligncenter" width="841"][](http://ncc-college.com/wp-content/uploads/2020/10/圖8.png) 圖8牛樟芝萃取物對癌細胞FAK, ERK1/2, p38 和 JNK1/2的影響[/caption] 為了評估EEAC對FAK和pFAK蛋白表現的影響，將CL1-0細胞使用不同濃度的EEAC (0、0.125、0.25、0.5和1.0 g/ml) 各36小時。 如圖8所示，當EEAC濃度高於0.5μg/ml時，EEAC顯著抑制CL1-0細胞中的pFAK表現。 將CL1-0細胞在使用EEAC（0.125–1.0 g/ml）36小時後，進行MAPK磷酸化分析。圖8中的數據表明EEAC在0.125至1.0 g/ml的濃度下顯著劑量依賴性地影響pFAK，p-JNK1/2和p-p38蛋白表現。 ## **3.****結論：** [caption id="attachment_4232" align="aligncenter" width="935"][](http://ncc-college.com/wp-content/uploads/2020/10/圖9.png) 圖9 牛樟芝EEAC介導抑制CL1-0癌細胞轉移的信號通路。[/caption] 研究顯示，牛樟芝萃取物(EEAC)顯著抑制了CL1-0癌細胞的轉移（使用Transwell測定法和wound scratch assay測定法評估）（圖3和4）。 牛樟芝EEAC顯著抑制MMP-2和MMP-9的活性（圖5）。研究結果表明，牛樟芝EEAC能抑制MMP-9和MMP-2活性而達成抗CL1-0肺癌細胞與抑制轉移。 這是首次從生化機制證明牛樟芝萃取物EEAC可以抑制人類肺腺癌CL1-0細胞轉移能力。 從機制上來說，EEAC抑制效果的發生是透過讓p-38與JNK1/2信號通路失去作用+抑制FAK和p-FAK蛋白表現+抑制PI3K和磷酸化AKT，從而降低了CL1-0癌細胞中MMP-2，MMP-9的活性表現（圖9），未來相關研究可能需要進一步的臨床研究來證明牛樟芝萃取EEAC作為抗癌藥的潛力。 [maxbutton id="12"]