【抗肺癌3】牛樟芝硫酸多醣體 抑制肺癌細胞生長與轉移的分子機制 Antrodia cinnamomea sulfated polysaccharide suppress lung cancer cell growth and migration

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論文發表在國際期刊: International Journal of Biological Macromolecules《國際生物大分子期刊》

 

根據 2019 年衛生福利部調查顯示，惡性腫瘤為國人十大死因之首，其中罹患氣管、支氣管和肺癌的病人為惡性腫瘤死亡率排名第一。

肺癌可分為非小細胞癌和小細胞癌兩種類型，其中非小細胞癌約佔所有肺癌 85%，小細胞癌約佔 15%。小細胞癌是最具侵略性的肺癌，與抽菸關係極為密切，且在確診時已有早期擴散的現象。儘管目前化學療法及標靶治療相當進步，但非小細胞癌的五年存活率仍低於 20%，而小細胞癌五年存活率僅 12.1%。

牛樟芝目前已被發現具有許多生物功能，包括促癌細胞凋亡、抗癌細胞轉移、抗血管新生、抑制癌細胞增生、調節免疫反應、抗氧化等作用。已在國際學術期刊中發表超過 400 篇有關牛樟芝的研究報告。

牛樟芝多醣體是牛樟芝中主要的活性物質之一，本篇研究探討牛樟芝硫酸化多醣體 (SPS) 如何藉由生理機制作用來降低轉化生長因子β（TGFβ）蛋白水平，並達成抑制肺癌細胞的活力和遷移。是國家中醫藥研究所、台北醫、陽明醫、中研院等共同研究發表。

TGFβ (Transforming Growth Factor Beta, ) 稱為「乙型轉化生長因子」是一種人類體內皆有的多功能細胞激素，參與許多重要的生理過程，例如胚胎發育、細胞生長與分化、傷口癒合、細胞凋亡、血管新生及免疫調控等。是一種具有多功能的細胞激素，在人體內，眾多類型的細胞皆具有產生並分泌此種細胞激素的能力。

TGFβ扮演抑制或促進疾病的雙重角色，研究發現，癌症的發生與轉移、失智症、動脈硬化、自體免疫疾病等疾病的病程演進，皆和TGFβ息息相關。

TGFβ在癌症扮演的角色依病程有所不同，在正常細胞(如上皮細胞)上，TGFβ能抑制細胞生長，當TGFβ功能降低或喪失時，都可能造成細胞異常增生。細胞異常增生是正常細胞變成癌細胞的必經之路；換句話說TGFβ作用是抑制癌症發生不可或缺的細胞激素。然而，對已經癌化的細胞，TGFβ反而會促使癌細胞轉移，使病程更加惡化，尤其在較為後期的腫瘤組織中，往往有大量的TGFβ表現。

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1. 研究摘要：

食用牛樟芝的硫酸化多醣體(SPS: Sulfated polysaccharides )已被鑑定為新型免疫調節劑。此研究通過進行一系列體外試驗研究來評估牛樟芝硫化多醣SPS的抗癌作用。研究中發現，樟芝硫化多醣SPS誘導細胞週期停滯和激活caspase 3和PARP抑制A549和LLC1肺癌細胞株的生長。對比之下，我們發現非硫化多醣（NSPS）不具抑制肺癌細胞的活性。此外，NSPS不會對A549和LLC1肺癌細胞造成細胞週期分布改變或啟動凋亡相關分子。

轉化生長因子β（TGFβ）和TGFβ受體（TGFR）的過度表達與肺癌腫瘤發生有關。牛樟芝硫化多醣SPS可抑制TGFβ誘導的細胞內信號傳導，包括Smad2/3、FAK、Akt的磷酸化和細胞遷移。相比之下，非硫酸化多醣（NSPS）在A549和LLC1細胞中均未表現出相似的生物學功能。

從生理機制上，我們證明了樟芝硫化多醣SPS透過蛋白酶體依賴性降解途徑來有效降低TGFR蛋白。本研究是首次確定SPS在引發TGFR降解與caspase 3和PARP活化中扮演關鍵角色，從而抑制肺癌細胞的存活和遷移。

 

2. 介紹

先前的研究顯示，硫酸化多醣體具有多種生物活性，已被用於治療各種疾病。例如，從褐藻中分離出一種硫酸化多醣，它具有抗血管生成，抗腫瘤和抗炎的活性。

牛樟芝是台灣獨特的藥用真菌/菇菌，經學者研究指出，牛樟芝具有免疫功能與多種生物活性，可促進身體健康並可用於治療人類疾病。近來，牛樟芝已被證明具有藥理活性，例如抗腫瘤、保肝、抗氧化和免疫調節作用。例如，牛樟芝萃取物已顯示出抑制癌細胞增殖/活力並誘導細胞凋亡(癌細胞自殺)或細胞週期停滯(癌細胞增生停滯)以及抑制各種癌細胞的遷移/侵襲(癌細胞擴散)的潛力。更新的研究指出，通過牛樟芝乙醇提取物、多醣和順鉑的合併治療，可以在細胞和動物模型中更有效的抑制小鼠肺癌的腫瘤發生。

在脂多醣（LPS）刺激RAW264.7巨噬細胞產生發炎實驗中，樟芝硫化多醣SPS的抗炎活性顯示了對腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）有抑制釋放的作用。

我們先前的研究發現，SPS增強了阿黴素對各種人類腫瘤細胞的細胞毒性（包括乳腺癌，肺癌和結腸癌細胞） [1]；在我們目前的研究中，我們仔細分析了SPS抑制腫瘤生長能力和造成腫瘤細胞凋亡的過程。

轉化生長因子β1（TGFβ1）在癌的發生和轉移上扮演重要角色[6]。在肺癌晚期，TGFβ1細胞激素過度分泌被認為會促進腫瘤進展並加速造成癌細胞轉移[7]。這些TGFβ經細胞內信號傳導而促成基因表現，會促進包括人類肺腺癌在內的各種癌細胞的腫瘤進展、遷移和轉移[2-5]

UPP (ubiquitin-proteasome pathway) 為一主要的蛋白質分解系統。此路徑不但負責一些短生命期及長生命期蛋白質的分解，對於一些腫瘤抑制因子、轉錄因子及細胞週期的調控蛋白亦具同樣作用。改變這些蛋白質的分解，對於腫瘤的生長及細胞凋亡有著深遠的影響。UPP參與了TGFβ信號網路的負向調控。研究指出通過促進TGFR降解來阻斷TGFR介導的信號是一種新的癌症治療策略。

本研究證明，樟芝硫化多醣SPS不僅抑制肺癌細胞的生存，而且還降低TGFR的蛋白表現並阻斷TGFR調控的細胞內信號通路。樟芝硫化多醣SPS在促進TGFR降解以及誘導肺癌細胞停滯和凋亡中應具關鍵角色。 因此，SPS可用作抑制肺腫瘤發生的潛在膳食補充劑。

 

3. 結果與討論：

3.1 SPS抑制人類A549肺癌細胞和小鼠LLC1肺癌細胞的增生

對A549和LLC1肺癌細胞進行一系列不同SPS(樟芝硫化多醣)濃度與時間處理，再對細胞生長進行分析。如圖2A和B所示，MTT分析顯示，A549和LLC1肺癌細胞分別在濃度400和800 ug / ml 的SPS處理72小時後，與對照組相比， 樟芝硫化多醣SPS對A549和LLC1肺癌細胞的生長抑制約為15-22％和25-32％。

有趣的是，我們發現NSPS(樟芝非硫化多醣)不能調降A549和LLC1細胞的生長能力（圖2C和D）。 這些結果表明只有樟芝硫化多醣可顯著抑制肺癌細胞的增殖。

圖2 ：SPS與NSPS抑制細胞活性測試

 

3.2 SPS誘導G2期細胞週期阻滯和體外凋亡相關反應

我們進一步分析了樟芝硫化多醣SPS對A549和LLC1癌細胞的細胞週期的影響。我們發現，與未經處理的對照細胞相比，經SPS處理（400mg / ml，持續48h），在sub-G1階段A549癌細胞從1.3％增加到3.7％；LLC1癌細胞從2.9％增加到3.2％（圖3A）。SPS在G2 / M階段造成A549癌細胞從14.2％增加到18.0％；LLC1癌細胞從18.0％增加到22.4％（圖3A）。這些結果表明，SPS可誘導肺癌細胞凋亡和細胞週期停滯。但是，NSPS不會誘導細胞週期分佈的變化。

接下來，我們研究了SPS誘導A549和LLC1細胞凋亡的相關機制。通過西方墨點法分析，樟芝硫化多醣SPS（400mg / ml）顯著造成促凋亡蛋白caspase-3的活化，且具時間相關性(時間越長效果越顯著) (圖3B)。我們還發現，在處理48小時後，SPS劑量相關性地誘導了A549和LLC1細胞中caspase-3、ADP-ribose與PARP的活化（圖3C）。

圖3 ：SPS誘導細胞週期停滯並促進A549和LLC1細胞的凋亡

 

3.3 SPS在肺癌細胞中抑制TGFR信號分子活性和癌細胞遷移

TGFβ1介導的細胞內途徑，包括Smad途徑（Smad2 / 3）和非Smad途徑分子（例如Akt和FAK），在腫瘤進展和肺癌轉移中扮演至關重要的作用[6,7]。  本研究檢查了SPS是否抑制Smad和非Smad途徑的活性。如圖4A所示，我們發現SPS以劑量相關性方式降低了A549和LLC1肺癌細胞中Smad 2/3的磷酸化。我們還發現，與對照細胞相比，在處理24和48小時後，SPS降低了癌細胞AKT（pAKT）和FAK（pFAK）的磷酸化（圖4B和4C）。

我們發現，SPS降低了A549細胞中TGFβ 1誘導的Smad 2/3、AKT和FAK的磷酸化（圖4E）。由於已知FAK參與癌細胞遷移和侵襲，因此我們進一步研究了SPS對細胞遷移的影響。我們發現，與對照組細胞相比，SPS分別在有和沒有TGFβ參與下抑制A549細胞的遷移約25％與 40％（圖4F）。

綜合以上，這些數據表明， 透過TGFβ1參與的細胞內傳遞路徑造成肺癌細胞凋亡，進而表現出SPS對肺癌細胞的生存力和遷移的抑制效果。

圖4 ：SPS抑制TGFR介導的Smad和非Smad依賴性信號分子，並抑制TGFβ1刺激的細胞遷移

 

3.4 SPS造成蛋白酶體相依的TGFR降解

如圖5A-C所示，透過西方墨點和流式細胞分析法，樟芝硫化多醣SPS以劑量相關的方式迅速下調了肺癌細胞中TGFRI和TGFRII蛋白的表現(相較於未經SPS處理)。此外，我們發現SPS處理48小時顯著下調了TGFRs的表達（圖5D）。綜上所述，這些結果表明SPS在抑制TGFR表現上扮演重要關鍵作用。

先前研究指出，UPP可加速降TGFR [8]。接下來，我們調查了SPS誘導的TGFR降解是否依賴於UPP介導的降解。一如預期，經SPS（200 ug / ml）處理過後，分別導致A549和LLC1肺癌細胞的TGFRI蛋白程度降低40％和50％（圖6B）。與單獨用SPS處理的細胞相比，在細胞中添加蛋白酶體抑製劑MG-132可以幫助SPS誘導的TGFRs蛋白質降解（圖6B）。

綜合上述研究表明，SPS在加速肺癌細胞中TGFR降解方面具有獨特的功效與活性。

圖5 : SPS抑制TGFRI和TGFR I​​I表達

 

圖6 ：SPS誘導蛋白酶體媒介的TGFR降解

 

4. 結論：

我們發現樟芝硫化多醣SPS抑制癌細胞存活和遷移的機制之一取決於在肺癌細胞中促進蛋白酶體媒介的TGFRs降解並同時抑制TGFR介導的Smad和非Smad信號通路。 我們首先證明SPS可通過誘導細胞週期停滯和凋亡相關反應來直接調節細胞生存，而NPSP不具有抗腫瘤活性。本研究發現SPS在下調TGFR與抑制腫瘤進展中具有關鍵作用。因此，樟芝硫化多醣SPS極具潛力可以作為飲食補充或治療手段來抑制肺癌細胞生長。

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參考文獻:

  1. J. Cheng, C.C. Chang, C.H. Chao, M.K. Lu, Characterization of fungal sulfated polysaccharides and their synergistic anticancer effects with doxorubicin, Carbohydr. Polym. 90 (2012) 134-139.
  2. N. Tang, W.Q. Ding, X J. Guo, X.W. Yuan, et al,, Epigenetic regulation of Smad2 and Smad3 by proflin-2 promotes lung cancer growth and metastasis, Nat. Commun. 6 (2015) 8230.
  3. F. Vazquez, M.j. Carlini, M.C. Daroqui, L. Colombo, et al., TGF-beta specifically enhances the metastatic attributes of murine lung adenoca rcinoma: implications for human non-small cell lung cancer, Clin. Exp. Metastasis 30 (2013) 993-1007.
  4. L. Welm, TGFbeta primes breast tumor cells for metastasis, Cell 133 (2008) 27-28.
  5. C. Xu, L.M. Wu, W. Sun, N. Zhang, et al., Effects of TGF-beta signaling blockade on human A549 lung adenocarcinoma cell lines, Mol. Med. Rep. 4 (2011) 1007-1015.
  6. Dumont, C.L. Arteaga, Targeting the TGF beta signaling network in human neoplasia, Cancer Cell 3 (2003) 531-536.
  7. Sterlacci, D. Wolf, S. Savic, W. Hilbe, et al., High transforming growth factor beta expression represents an important prognostic parameter for surgically resected non-small cell lung cancer, Hum. Pathol. 43 (2012) 339-349.
  8. Izzi, L. Attisano, Regulation of the TGFbeta signalling pathway by ubiquitin-mediated degradation, Oncogene 23 (2004) 2071-2078.

NiuChangChih牛樟芝功效 (pharmacological effects of Antrodia cinnamomea)：

保護肝臟(hepato-protective)、解酒(anti-hangover)、抗癌(anti-cancer)、抗過敏(anti-allergenic)、增強免疫力(strengthen immune system)、降高血壓(antihypertensive)、降高脂血(antihyperlipemic)、降血糖(anti-diabetic)、免疫調節(immunomodulatory)、抗氧化(anti-oxidant)、抗發炎(anti-inflammatory)

NiuChangChih牛樟芝的主要成份 (bioactive components of Antrodia cinnamomea)：

三萜類（Triterpenoids）、多醣體（Polysaccharides）、腺苷（Adenosine）、超氧歧化酶（SOD）、麥角固醇（Ergosterol）、羊毛固醇（Lanosterol）、免疫蛋白（Immunity Protein）、維生素（Vitamins）、核酸（Nucleic Acid）、胺基酸（Amino Acid）、苯類(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinone derivates )、馬來酸（Maleic acid）琥珀酸（Succinic acid）、凝集素（Lectin）、木質素（Lignin）、血壓穩定物質（Antrodia acid）、礦物質（鈣、磷、鐵、鍺等）

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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