【抗食道癌1】牛樟芝增強食道癌細胞的放射敏感性與調節DNA修復 Antrodia cinnamomea enhances the radiosensitivity of human esophageal cancer cells

論文發表在國際期刊: Onco Targets and Therapy (腫瘤標靶與治療期刊)

裕隆集團董事長嚴凱泰3日因食道癌病逝台北榮總，享年54歲，令人不勝唏噓…
在家庭最需要他的時後辭世，尤其令人心痛~
對裕隆集團與所有人而言，也痛失一位少康中興、勇於追夢、形象正面的優質CEO
加上前一日藝人安迪也同樣因食道癌病逝
讓大家驚覺食道癌竟是【無聲殺手】!
學院為此特別整理此篇與食道癌有關的牛樟芝研究

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食道癌(esophageal cancer)有著高死亡率，平均5年生存率不超過25％。局部晚期食道癌以目前的治療方法通常難以治療，且難以預測。現行的放化療（CCRT: Concurrent chemoradiotherapy）是癌症晚期，面對不可切除或不能手術時的標準治療方法。儘管有各種治療方法，包括手術，CCRT和化療方案，但食道癌的預後很差，存活率的中位數為29個月，3年存活率為44.7％，5年存活率為36.8%。針對食道癌，順鉑(Cisplatin)是最常用於CCRT的主要化療藥物，也有充分的臨床資料佐證，然而，在腎毒性和抗藥性仍有疑慮。因此，食道癌患者迫切需要新型和有效的化合物，以期能控製或改善局部和遠端腫瘤的發展。

放射療法是現行常見的癌症治療方法之一，放射療法是以高劑量的放射線將癌細胞殺死，不可避免的卻會傷害到鄰近的正常細胞，產生副作用。如果能使癌細胞對放射線敏感度提升，就可以降低放射療法時所需的放射線強度，降低對正常細胞的傷害。

牛樟芝(NiuChangChih, Antrodia cinnamomea)已被證實可對抗癌症且有很多研究都試著從牛樟芝的成分中找出抗癌的活性化合物。本研究針對牛樟芝是否可增加食道癌細胞對放射治療的敏感性進行研究，以期能讓放療效果提升，促成癌細胞凋亡與減緩腫瘤成長。研究由台灣台北榮民醫院、陽明大學、長庚大學與中國醫藥大學共同研究，並獲國際癌症治療期刊選用(Onco Targets and Therapy)。

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1.摘要

本研究針對研究牛樟芝AC-MFB (Antrodia cinnamomea mycelial fermentation broth)是否可增加食道癌細胞對放射治療的敏感性。本研究針對CE81T / VGH和BE3兩種食道癌細胞進行研究。

在癌細胞聚落結構分析中(colony formation assay)發現，經牛樟芝AC-MFB 預處理，會讓放射照射後的食道癌細胞的存活率下降，增敏物增強率為1.91％，存活率為37％。DNA直方圖研究顯示，經牛樟芝AC-MFB 預處理，能增強G2 / M期的細胞週期停滯，此階段對放射敏感性最高。免疫螢光試驗和蛋白質印跡試驗中顯示出，牛樟芝AC-MFB延遲γ-H2AX的消除，上調p21表現，並減弱輻射造成的ATM與checkpoint 2激酶的磷酸化，讓癌細胞的修復受到阻斷。

在動物實驗中(BALB/c mice) 發現，食用牛樟芝AC-MFB並搭配放射治療產生了增效作用，能對CE81T/VGH食道癌細胞的腫瘤造成生長延遲。這些數據表明，在對抗食管癌的治療中，牛樟芝可以增強放射治療的效果。

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2.研究結果

2.1牛樟芝對食道癌細胞活性與放射敏感性的效果

兩種食道癌細胞(CE81T/VGH與BE3)經使用不同濃度牛樟芝(0.1-5 mg/mL)，與不同時間作用(24,48或72小時)；發現牛樟芝在抑制食道癌細胞活性上與牛樟芝濃度呈現正相關(濃度越高，抑癌效果越好)。CE81T/VGH 與 BE3食道癌細胞的IC₅₀數值分別是1.0與1.1 mg/mL (下圖A與B)。

CE81T/VGH和BE3食道癌細胞，經不同放射劑量後(放射劑量0-6 Gy)，使癌細胞存活率減少23％和25％。使用0.5 mg/mL牛樟芝後，再經放射照射後的CE81T/ VGH腫瘤細胞，存活率顯著的減少 (下圖C與D)。

2.2牛樟芝對食道癌細胞(CE81T/VGH)在細胞週期分布的作用

使用DNA柱狀分析法，在細胞週期分布上，評估牛樟芝是否影響食道癌細胞的放射敏感性，使用0.5或1.0 mg/mL濃度牛樟芝AC-MFB，經24小時，發現與未使用牛樟芝組相較，牛樟芝組在G0/G1階段癌細胞比例是下降的。在S階段，癌細胞比例有輕微增加(下圖)。

未經放射照射條件下，在G2/M階段，未使用牛樟組食道癌細胞比例顯著維持在25.3％至25.3％；相較之下牛樟芝組(1.0 mg / mL)，癌細胞比例分別為24.9％至19.3％。(見上圖淺藍底色數值)

經放射照射(IR)後，在G2/M階段，未使用牛樟芝組食道癌細胞比例會快速增加，在24小時增加到34.6%；但隨後會顯著的減少，在48小時為15.1% ，在72小時為11.3%，代表DNA受損傷，並引發後續的DNA修復。(見上圖粉紅底色數值)

經放射照射(IR)後，在G2/M階段，相較之下牛樟芝組(1.0 mg / mL) 能維持G2/M癌細胞的比例，在24小時為25.9％，在48小時為25.2％，在72小時為15.5%。(上圖粉紅底色數值)

上述研究中發現，癌細胞經放射照射後，牛樟芝AC-MFB可透過影響DNA損傷修復來阻斷癌細胞週期的恢復。

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2.2牛樟芝造成食道癌細胞(CE81T/VGH)凋亡

根據DNA直方圖的變化，放射照射對食道癌細胞(CE-81T/ VGH) 造成中度有絲分裂停滯(下圖箭頭所指)，且牛樟芝(AC-MFB)進一步增強有絲分裂停滯細胞的積累 (下圖A-D)。圖A為控制組，圖B為牛樟芝組，圖C為放射照射組，圖D為牛樟芝搭配放射組。

在流式細胞分析中顯示，單獨使用牛樟芝下，濃度增加可增加癌細胞凋亡率，牛樟芝濃度0.5 mg/mL時，凋亡率從2.00 %到9.18 %；牛樟芝濃度1.0 mg/mL時凋亡率從2.00 % 到 12.34 % (下圖E)。放射照射搭配牛樟芝更能顯著提升癌細胞凋亡率，放射照射搭配牛樟芝濃度0.5 mg/mL，凋亡率從2.64% 提升到10.11%；照射搭配牛樟芝濃度1.0 mg/mL，凋亡率從2.64% 提升到37.37%。

2.4牛樟芝調控癌細胞損傷修復機制

當細胞被放射照射後會造成雙股DNA損壞時，ATM (ataxia-telangiectasia mutated) 與ATR (ataxia-telangiectasia and Rad3-related)就會被啟動，進而活化(磷酸化) BRCA1，DNA受損處會有γ-H2AX和BRCA1聚集，γ-H2AX會產生一連串的訊號傳遞吸引細胞中的DNA修復蛋白前來，修復損壞的DNA。γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂的指標。

牛樟芝可延遲因放射(IT)造成γ-H2AX表現停止的現象。如下圖免疫螢光法中所示。

西方墨點分析法也顯示牛樟芝(AC-MFB)能顯著的增加γ-H2AX表現，尤其是單獨使用牛樟芝 (P=0.013，1小時)。也觀察到放射照射(IR)搭配牛樟芝(AC-MFB)有增效的作用 (分別是P=0.013與P=0.008，6小時後)(下圖)。
放射照射(IR)造成ATM磷酸化表現 (P=0.018，1小時後)，搭配牛樟芝則顯著降低ATM磷酸化(P=0.006，6小時後)。放射照射(IR)會增加Chk2 (checkpoint kinase 2)磷酸化，而牛樟芝(AC-MFB)降低Chk2磷酸化，等於降低DNA受損修復能力。

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2.5動物實驗中牛樟芝抑制食道癌腫瘤成長

在動物實驗中(BALB/c mice)，免疫缺陷鼠植入食道癌細胞(CE81T/VGH)，在口服餵食100μL牛樟芝（1.0 mg / mL），經34天配合放射治療發揮了增效作用，能使腫瘤生長延遲。

實驗中，同樣以腫瘤體積增加5倍，控制組需15.2天。單獨使用AC-MFB治療，腫瘤生長可延遲19.0天；單獨使用放射治療，腫瘤生長可延遲19.6天；協同治療(放療+牛樟芝)則可延遲到22.5天(圖6A)。在白血球數量與體重上則無顯著差異(圖6B, 6C)。

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牛樟芝功效 (pharmacological effects of Antrodia cinnamomea)：

保護肝臟(hepato-protective)、解酒(anti-hangover)、抗癌(anti-cancer)、抗過敏(anti-allergenic)、增強免疫力(strengthen immune system)、降高血壓(antihypertensive)、降高脂血(antihyperlipemic)、降血糖(anti-diabetic)、免疫調節(immunomodulatory)、抗氧化(anti-oxidant)、抗發炎(anti-inflammatory)、神經保護(neuro-protective)、心血管保護(cardio-protective)作用

牛樟芝的主要成份 (bioactive components of Antrodia cinnamomea)：

三萜類（Triterpenoids）、多醣體（Polysaccharides）、腺苷（Adenosine）、超氧歧化酶（SOD）、麥角固醇（Ergosterol）、羊毛固醇（Lanosterol）、免疫蛋白（Immunity Protein）、維生素（Vitamins）、核酸（Nucleic Acid）、胺基酸（Amino Acid）、苯類(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinone derivates )、馬來酸（Maleic acid）琥珀酸（Succinic acid）、凝集素（Lectin）、木質素（Lignin）、血壓穩定物質（Antrodia acid）、礦物質（鈣、磷、鐵、鍺等）