抗大肠癌1】牛樟芝三萜类毒杀大肠癌细胞与作用机制 Cytotoxic triterpenes from Antrodia camphorata and their mode of action in HT-29 human colon cancer cells
论文发表在美国期刊: Cancer Letters (美国癌症期刊)
卫福部国健署2017/12/28公布最新癌症统计报告(统计至2015年)。 2015年癌症新发人数为10.5万人，较前一年增加2009人，每10万人就有302人罹癌，平均每5分钟就有1人罹癌。
2015年国人发生人数最多，前十名癌症与2014年相同，排行榜依序为大肠癌、肺癌、乳癌、肝癌、口腔癌（含口咽、下咽）、摄护腺癌、胃癌、皮肤癌、甲状腺癌、食道癌。
由性别来看，男性口腔癌与食道癌症发生，为女性的11.6倍与15.8倍，男性癌患发前5名为大肠癌(Colon Cancer)、肝癌(Hepatoma)、肺癌(Lung Cancer)、口腔癌、摄护腺癌；女性则为乳癌(Breast Cancer)、大肠癌(Colon Cancer)、肺癌(Lung Cancer)、肝癌(Hepatoma)及甲状腺癌(Thyroid Cancer)。
大肠癌十度蝉联十大癌症发生人数首位!!
一直以来，牛樟芝在抗癌研究上吸引很多学者投入研究，大肠癌当然也不例外! 本篇研究由台湾国家健康研究院+台北医学大学+加拿大国家研究委员会(生技研究所)共同研究，牛樟芝三萜类的复合物在毒杀大肠癌细胞的效果显著，并获美国癌症期刊选用(Cancer Letters)。
National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes, Taiwan
Cancer Center, Wan Fang Hospital, Taipei Medical University, Taiwan
Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada, Montreal, Quebec, Canada
1.摘要
牛樟芝生长于死亡牛樟树的木质部，已被华人当作中药并广泛用于食物/药物中毒，腹泻，腹痛，高血压和癌症等。牛樟芝富含三萜类，三萜类是抗癌的主要活性成分，牛樟三萜类种类超过200种以上，厘清不同三萜与抗癌的效果，一直是学者研究的重点。
本研究从牛樟芝纯化出8种复合物，包括5种羊毛固醇(2,3,4,6,8)与3种麦角固醇(1,5,7)，透过体外实验去评估不同复合物对不同种类癌细胞的毒杀(细胞毒性: cytotoxic)效果。
透过IC50评估，三萜复合物1,5,7毒杀癌细胞效果最好，8种复合物对人类正常细胞mammary epithelial (人类乳腺上皮细胞)与foreskin fibroblast(人类皮肤纤维母细胞)均无毒性。
三萜复合物1,5,7展现出可造成大肠癌细胞(HT-29, SW-480)死亡(凋亡)；也确认能在sub-G1阶段阻止癌细胞复制。
三萜复合物1,5,7可阻断sub-G1阶段的癌细胞复制，并透过裂解PARP(DNA修复酶)、Bcl-2(抗凋亡蛋白)与procaspase-3(未活化凋亡蛋白)来造成癌细胞凋亡。此外，三萜复合物1,5,7的混合物质，表现出具潜力的协同毒杀大肠癌细胞(HT-29)的作用。
三萜复合物1,5,7各4 μM的混合物质，在毒杀大肠癌细胞(HT-29)表现出最好的效果。
2.前言
癌症在全球造成很多病患死亡也对生活带来很多问题，包括: 生理与心理的痛苦也造成了经济上莫大的压力。因此，医界一直努力希望能在癌症治疗上有所突破，虽已开发出相关的抗癌制剂，然而无可避免的，抗癌制剂也带来了许多问题，像副作用与抗药性。
为了解决这些困难，开发癌症预防制剂 (cancer chemopreventive agents ) 与改善癌症治疗方法( cancer treatment)就显得相当重要。从纯自然的天然植物中找出具潜力的抗癌制品来当作营养补充就显得相当重要。
天然的三萜类(Triterpenoids)具有多种药理特性，引起研究团队的兴趣，并从牛樟芝纯化出8种三萜类复合物，包括5种羊毛固醇(2,3,4,6,8)与3种麦角固醇(1,5,7)，展开体外实验。
从研究结果中显示，8种三萜类复合物在体外实验中，可有效毒杀大肠癌、肝癌、乳癌与肺癌细胞，见图1。
3.研究结果与讨论
3.1细胞复制研究
使用10种不同癌细胞与2种正常细胞进行体外实验，并与8种三萜类复合物进行细胞复制实验，经48小时候透过sulforhodamine B assay (SRB)比色法来检测癌细胞增殖。
三萜复合物1,5,7对应不同癌细胞，表现出较广泛的毒杀效果，IC50的数值分布在22.3~75.0μM (表1)。实验发现当IC50 < 30μM在抗癌将有最高的效力。其中三萜复合物1又较三萜复合物5,7更有效果，包括大肠癌细胞(HT-29, SW-480)、肝癌细胞(Huh-7, Hep G2)、乳癌细胞(MDA-MB -231)与肺癌细胞(A-549)的IC50 < 30μM。
三萜复合物1对Hep G2肝癌细胞展现出较强的成长抑制性(IC50 = 23.4 μM)，对Hep 3B肝癌细胞则呈现中度的成长抑制性(IC50 = 68.3 μM)。三萜复合物1对MDA-MB-231乳癌细胞展现出较强的成长抑制性(IC50 = 25.1 μM)，对MCF-7乳癌细胞则呈现中度的成长抑制性(IC50 = 57.8 μM)。
三萜复合物1对所有癌细胞的抑制性都相当明显。三萜复合物5在肺癌与肝癌细胞上就稍不如三萜复合物1。三萜复合物7在大肠癌细胞的抑制表现较显著。
8种复合物对人类正常细胞无抑制性或不显著，包括 MCF10A人类乳腺上皮细胞(mammary epithelial)与 HS68人类皮肤纤维母细胞 (foreskin fibroblast)。
三萜复合物2,3,4,6,8在不同癌细胞的表现上出现较大差异性。三萜复合物3在大肠癌细胞较具毒杀性，在抗HT-29, HCT-116与SW-480癌细胞上，对应IC50的数值为59.8, 79.9 与86.5μM；三萜复合物3在抗肺癌细胞(A-549, CL1-0)上则不明显(IC 50 > 500 μM)。
3.2人类大肠癌细胞的细胞周期阻滞和凋亡
研究为了观察到细胞毒性作用是否是造成癌细胞凋亡，将三萜复合物1-8施用50μM于HT-29大肠癌细胞，经培养细胞48小时，检测HT29细胞中的sub-G1积累的凋亡癌细胞数量比。通过流式细胞分析检查细胞周期（sub-G1）。
与控制组凋亡比例0.77%相较，三萜复合物1,5,7造成HT29大肠癌细胞在sub-G1阶段的凋亡比例分别为41.7%, 32.7% 与29.5%，三萜复合物1 ,5,7显著造成HT29大肠癌细胞凋亡 (图2)。
三萜复合物1,5,7接着以25-100μM不同浓度，经培养细胞48小时，来测试抗大肠癌细胞(HT-29, SW480)效果。测试结果显示出三萜复合物1,5,7可以造成大肠癌细胞凋亡(死亡)，且有剂量相关性(浓度越高效果越好)，见图3。与表1的癌细胞毒杀结果相互呼应。
从图3可以发现三萜复合物1随着浓度增加，造成大肠癌细胞(HT-29, SW480)的凋亡比例越高，在浓度100μM时凋亡率分别为HT-29: 37.76% 与SW480 : 30.70% (图3 红框所示)。同样，三萜复合物5,7也有相同趋势，在浓度100μM时SW480凋亡率分别为三萜复合物5: 23.8% 与三萜复合物7: 27.8%。
3.3 PARP，Bcl-2和pro-caspase-3对HT-29癌细胞造成的结果
细胞凋亡是有顺序的过程，其中发生多种事件，包括关键调节分子的后转译修饰，例如蛋白激酶、Bcl-2家族(抗凋亡蛋白酶)和caspases(促凋亡蛋白酶)。三萜类能引发癌细胞凋亡并造成癌细胞复制周期停滞。本研究安排相关实验去验证三萜复合物1~8,造成HT-29癌细胞凋亡的能力，并透过西方墨点分析法进行分析。
使用三萜复合物1,5,7，会使PARP(DNA修复酶)裂解升高，见图4。更具体地说，在使用三萜复合物1,5,7经48小时后细胞核中PARP的裂解形式显著增加，而核全长的PARP则减少(图4)。在Bcl-2(抗凋亡蛋白)与 procaspase-3(未活化凋亡蛋白)的表现也发现类似的抑制效果。在细胞凋亡过程中，PARP被活性caspase-3直接蛋白水解，导致PARP失去活性无法对DNA进行修复(即无法修复癌细胞)。
三萜复合物1,5,7可阻断sub-G1阶段的癌细胞复制，并透过裂解PARP(DNA修复酶)、Bcl-2(抗凋亡蛋白)与procaspase-3(未活化凋亡蛋白)来造成癌细胞凋亡。
三萜复合物1,5,7在本研究中持续一至性的表现出透过粒线体有关的路径介导，可造成HT-29癌细胞凋亡，见图3与图4。
3.4三萜复合物综合治疗在大肠癌细胞的成长抑制性
接下来针对HT-29大肠癌细胞，以三萜复合物1,5,7进行癌细胞毒杀试验，分为: (1)单一三萜复合物1,5,7搭配不同浓度(6,12 μM)；(2)混合三萜复合物1,5,7 (4,6 μM)，进行SRB assay检测分析，见图5。
如图5所示，混合三萜复合物1,5,7时，各复合物单一剂量最低时(4 μM)对HT-29大肠癌细胞的达到最大抑制能力。
如图5，三萜复合物1,5,7各自单一使用时，不论浓度是6或12 μM，癌细胞活性普遍高于混合三萜复合物1,5,7使用。混合使用分为1+5、1+7、5+7 (混合2种)与1+5+7 (混合3种)，可以发现混合2种三萜复合物的癌细胞活性普遍比使用单一三萜复合物来的低，癌细胞活性被抑制率分别为1+5: 67.1%、1+7: 63.7%、5+7: 47.0% (图5 蓝框所示)。而混合3种三萜复合物的癌细胞抑制能力最强，所以癌细胞活性最低，癌细胞活性被抑制率达85.6% (图5 红框所示)。
4.结论
结论，本研究已经证明来自牛樟芝的三萜类能抑制大肠癌，肝癌，乳腺癌和肺癌细胞系中的细胞增殖。
三萜复合物也阻止了sub-G1阶段的细胞周期的进展;另外，透过下游PARP，pro-caspase-3和Bcl-2的裂解，造成大肠癌细胞凋亡。
此外，三萜复合物混合使用在HT-29细胞中表现出有效的协同毒杀癌细胞作用。值得进一步研究以确定体内抗肿瘤活性并阐明其潜在的作用机制。
【注】本研究受国家科学委员会(台湾)和国家卫生研究院(台湾)的资助。
牛樟芝(Niuchangchih, Antrodia cinnamonmea)的生理活性成份为：三萜类（Triterpenoids）、多糖体（Polysaccharides）、腺苷（Adenosine）、超氧歧化酶（SOD）、麦角固醇（Ergosterol）、羊毛固醇（Lanosterol）、免疫蛋白（Immunity Protein）、维生素（Vitamins）、核酸（Nucleic Acid）、胺基酸（Amino Acid）、苯类(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinone derivates )、马来酸（ Maleic acid）琥珀酸（Succinic acid）、凝集素（Lectin）、木质素（Lignin）、矿物质（钙、磷、铁、锗等）
