【抗肺癌2】牛樟芝萃取物透過MAPK與PI3K/AKT機制抑制人類肺腺癌轉移 Antrodia cinnamomea exhibit anti-migration action in lung adenocarcinoma through MAPK & PI3K/AKT

論文發表在荷蘭期刊: Phytomedicine (植物醫學)

肺癌是全世界發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,癌細胞轉移是造成病患死亡的首要原因。癌細胞因增殖快速,需要足夠的營養和氧氣,因此,必須侵蝕周圍正常細胞並要求新生血管來提供癌細胞增長所需條件,更可能經由血液和淋巴系統擴散至其他組織器官,即所謂的轉移,這是造成罹癌患者的主要徵候,也是臨床治療中最難以根治與死亡的主要原因。

本篇為您介紹的牛樟芝研究是中國醫、中國醫附設醫院吳院長領軍與興大、成大共同研究,並獲荷蘭Phytomedicine (植物醫學期刊)選用於2012年發表。研究發現牛樟芝萃取物可抑制MMP-2、MMP-9的活性進而達成抑制肺腺癌細胞轉移。研究接著更進一步從生化機制去證實牛樟芝萃取物藉由MAPK與PI3K/AKT機制抑制癌細胞轉移。學者投入牛樟芝研究已超過十多年,逐步釐清牛樟芝抗癌效果與機制,發表在各領域專業國際期刊已累積超過300篇

腦補一下甚麼是蛋白酶? 蛋白酶是生物體內的一類酶(酵素),它們能夠分解蛋白質。
那MMP-2與MMP-9又是甚麼? MMP-2與MMP-9同屬於基質金屬蛋白酶(MMP:  Matrix metallopoateinase)家族的一份子。基質金屬蛋白酶 (MMP) 可以分解細胞外基質的結構蛋白,具有型態生成、血管生成、神經生成及細胞修復等組織重塑的能力 ; 但這能力也會促使癌細胞的增殖、遷移、分化、血管新生、及抑制細胞凋亡等作用。也就是說MMP與癌細胞的轉移和侵襲有關係!!

MMP(基質金屬蛋白酶)是一個大家族,在這麼多種MMP成員中,屬於明膠酶的MMP-2與MMP-9被認為與癌的轉移及血管生成特別具有相關性,過量表現的MMP-2和MMP-9也會促使癌細胞的生長、血管新生、侵襲及惡化,幫助癌細胞向外擴散。

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1.摘要:

癌症轉移是癌症死亡的主要原因。台灣藥用牛樟芝(Antrodia cinnamomea)已被證明具有抗氧化和抗癌活性。在本篇研究中,我們首先觀察到在對正常細胞不具有毒性的情況下,牛樟芝子實體的乙醇萃取物(EEAC)對人體肺腺癌CL1-0細胞的轉移和運動性具有濃度依賴性的抑制作用(濃度越高抑制效果越好)。

明膠酶譜測定(gelatin zymography)結果顯示牛樟芝萃取物在抑制MMP-2、MMP-9(基質金屬蛋白酶)的活性上具有濃度依賴性。

蛋白質西方點墨法測定(Western blot)的結果顯示,牛樟芝萃取物處理可降低MMP-9和MMP-2的表現。
牛樟芝萃取物(EEAC)裡的兩種主要化合物: 蟲草素(codycepin)和三萜類樟菇酸A(zhankuic acid A)可單獨或共同抑制MMP-9和MMP-2的表現。進一步研究發現,牛樟芝抑制了p38和JNK1/2的磷酸化。 牛樟芝還抑制PI3K的表現和AKT的磷酸化。這是第一份研究證實牛樟芝對人類肺腺癌細胞CL1-0具有抗轉移作用。

 

2.結果與討論:

2.1 牛樟芝萃取物(EEAC)對於人類肺腺癌CL1-0癌細胞的毒殺性分析

藉由MTT分析來測定不同濃度EEAC(0–128 μg/ml)對癌細胞活性的影響效果。 經培育24小時和36小時後,與未使用牛樟芝EEAC的控制組相比,低濃度EEAC(0.125–2 μg/ml)對癌細胞活力沒有顯著影響(圖2),這表明EEAC在低濃度下對CL1-0癌細胞無毒。癌細胞在使用高濃度EEAC (4.0–128 μg/ml) 24和36小時後,癌細胞活力出現顯著下降。 為了避免在接下來的實驗中抑制癌細胞活力, EEAC的濃度我們僅使用0.125–1.0 μg/ml區間,培育時間則為36 小時。

圖2

 

2.2 牛樟芝萃取物(EEAC)對CL1-0癌細胞遷移能力的測定(wound scratch assay)

使用wound scratch assay分析去評估EEAC對CL1-0癌細胞遷移的影響(圖3A)。培育36小時後,牛樟芝EEAC以劑量依賴性方式抑制CL1-0癌細胞的遷移能力,濃度0.5μg/ml抑制10.3%遷移力,濃度1.0 μg/ml抑制14.8%遷移力(圖3B)

圖3

 

2.3 牛樟芝萃取物(EEAC)對CL1-0癌細胞遷移的影響(體外測試)

使用Transwell測定法來分析CL1-0癌細胞在使用了EEAC 24小時後的遷移情況。研究發現添加0.25–1.0 μg/ml 牛樟芝EEAC可顯著降低CL1-0癌細胞的23%遷移力(圖4A,4B),且EEAC的抑制效果是具有劑量依賴性的(濃度越高抑制效果越好)。

圖4

 

2.4 牛樟芝萃取物(EEAC)抑制CL1-0細胞中MMP-2和MMP-9的活性

為了檢查EEAC可能的抗遷移機制,我們透過明膠酶譜分析去評估CL1-0癌細胞中MMP-2和MMP-9的活性。 在沒有使用牛樟芝EEAC的情況下,CL1-0癌細胞分泌高程度的MMP-9和MMP-2。 如圖5所示,牛樟芝EEAC以濃度依賴性方式抑制MMP-9和MMP-2活性(圖5A,5B)。 MMP-2和MMP-9被認為會促使癌細胞生長、血管新生、幫助癌細胞向外擴散。研究結果表明,牛樟芝EEAC能抑制MMP-9和MMP-2活性而達成抑制CL1-0肺癌細胞遷移。

圖5

 

2.5 牛樟芝萃取物(EEAC)對MMP-2和MMP-9的抑制性

為了檢查牛樟芝EEAC可能的抗遷移機制,我們透過蛋白質西方點墨法分析去評估CL1-0癌細胞中MMP-2和MMP-9的表現。 在沒有EEAC處理的情況下,CL1-0癌細胞有高程度的MMP-9和MMP-2表現。 如圖6A所示,EEAC以濃度依賴性方式抑制MMP-9和MMP-2的表現。

圖6

 

2.6 牛樟芝萃取物(EEAC)中主成分蟲草素、樟菇酸A對MMP-2和MMP-9抑制性

牛樟芝萃取物(EEAC)中有兩項主成分: 蟲草素與樟菇酸A。為了檢查蟲草素、樟菇酸A可能的抗遷移機制,我們透過蛋白質西方點墨法分析去評估CL1-0癌細胞中MMP-2和MMP-9的表現。在沒有使用牛樟芝EEAC的情況下,CL1-0細胞表現出高程度的MMP-9和MMP-2。 如圖6B所示,單獨使用蟲草素、樟菇酸A或同時使用蟲草素+樟菇酸,都可抑制MMP-9和MMP-2的表現。

 

2.7 牛樟芝萃取物(EEAC)對CL1-0癌細胞的PI3K、AKT、磷酸化AKT(pAKT)和Rac-1表現的影響

PI3K是一組分布甚廣的脂質激酶,在細胞信號傳導的主要途徑中扮演重要作用。各類型細胞在進行細胞增殖、分化和死亡過程中,PI3K / AKT扮演重要調節功能。
為了進一步研究PI3K / AKT的影響,進行了一系列實驗評估經牛樟芝EEAC刺激後傳訊分子的表現。 結果顯示,CL1-0癌細胞與牛樟芝EEAC(0.125–1.0 μg/ml)培養後,劑量依賴性地導致降低PI3K和pAKT(圖7),進而影響癌細胞信號傳遞。 但是,EEAC(0–1.0μ g/ml,36小時)對Rac-1蛋白表現沒有影響(圖7)。

圖7

 

2.8 牛樟芝萃取物(EEAC)對CL1-0癌細胞的FAK, ERK1/2, p38 和 JNK1/2磷酸化表現的影響

為了評估EEAC對FAK和pFAK蛋白表現的影響,將CL1-0細胞使用不同濃度的EEAC (0、0.125、0.25、0.5和1.0 g/ml) 各36小時。 如圖8所示,當EEAC濃度高於0.5μg/ml時,EEAC顯著抑制CL1-0細胞中的pFAK表現。
將CL1-0細胞在使用EEAC(0.125–1.0 g/ml)36小時後,進行MAPK磷酸化分析。圖8中的數據表明EEAC在0.125至1.0 g/ml的濃度下顯著劑量依賴性地影響pFAK,p-JNK1/2和p-p38蛋白表現

圖8

 

3.結論:

研究顯示,牛樟芝萃取物(EEAC)顯著抑制了CL1-0細胞的遷移(使用Transwell測定法和wound scratch assay測定法評估)(圖3和4)。 牛樟芝EEAC顯著抑制MMP-2和MMP-9的活性(圖5)。研究結果表明,牛樟芝EEAC能抑制MMP-9和MMP-2活性而達成抗CL1-0肺癌細胞與抑制遷移。 這是首次從生化機制證明牛樟芝EEAC抑制了人類肺腺癌CL1-0細胞遷移能力

從機制上來說,EEAC抑制效果的發生是透過讓p-38與JNK1/2信號通路失去作用+抑制FAK和p-FAK蛋白表現+抑制PI3K和磷酸化AKT,從而降低了CL1-0癌細胞中MMP-2,MMP-9的活性表現(圖9)。 未來相關研究可能需要進一步的臨床研究來證明牛樟芝EEAC作為抗癌藥的潛力。

圖9: 本篇研究推論EEAC介導抑制CL1-0細胞遷移的信號通路。 EEAC的作用可能是通過抑制FAK來實現的,FAK可以通過MAPK和PI3K / AKT信號通路調節MMP9的表現。

 


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NiuChangChih牛樟芝功效 (pharmacological effects of Antrodia cinnamomea)

保護肝臟(hepato-protective)、解酒(anti-hangover)、抗癌(anti-cancer)、抗過敏(anti-allergenic)、增強免疫力(strengthen immune system)、降高血壓(antihypertensive)、降高脂血(antihyperlipemic)、降血糖(anti-diabetic)、免疫調節(immunomodulatory)、抗氧化(anti-oxidant)、抗發炎(anti-inflammatory)

NiuChangChih牛樟芝的主要成份 (bioactive components of Antrodia cinnamomea)

三萜類(Triterpenoids)、多醣體(Polysaccharides)、腺苷(Adenosine)、超氧歧化酶(SOD)、麥角固醇(Ergosterol)、羊毛固醇(Lanosterol)、免疫蛋白(Immunity Protein)、維生素(Vitamins)、核酸(Nucleic Acid)、胺基酸(Amino Acid)、苯類(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinone derivates )、馬來酸(Maleic acid)琥珀酸(Succinic acid)、凝集素(Lectin)、木質素(Lignin)、血壓穩定物質(Antrodia acid)、礦物質(鈣、磷、鐵、鍺等)

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