【抗肺癌3】牛樟芝硫酸多醣体 抑制肺癌细胞生长与转移的分子机制 Antrodia cinnamomea sulfated polysaccharide suppress lung cancer cell growth and migration

论文发表在国际期刊: International Journal of Biological Macromolecules《国际生物大分子期刊》

根据 2019 卫生福利部调查显示,性肿瘤为国人十大死因之首,其中患气管、支气管和肺癌的病人为性肿瘤死亡排名第一

肺癌可分为非小细胞癌和小细胞癌兩种類型,其中非小细胞癌约占所有肺癌 85%,小细胞癌约占 15%。小细胞癌是最具侵略性的肺癌,与抽烟关系极为密切,且在确诊时已有早期扩散的现象。尽管目前化学療法及标靶治療相当进步,但非小细胞癌的五存活仍低于 20%,而小细胞癌五存活 12.1%

牛樟芝目前已被发现具有许多生物功能,包括促癌细胞凋亡、抗癌细胞转移、抗血管新生、抑制癌细胞增生、调节免疫反应、抗氧化等作用。已在国际学术期刊中发表超过 400 篇有关牛樟芝的研究报告。

牛樟芝多醣体是牛樟芝中主要的活性物质之一,本篇研究探讨牛樟芝硫酸化多醣体 (SPS) 如何藉由生理机制作用来降低转化生长因子β(TGFβ)蛋白水平,并达成抑制肺癌细胞的存活和迁移。是国家中医药研究所、台北医、阳明医、中研院等共同研究发表。

TGFβ (Transforming Growth Factor Beta, ) 称为「乙型转化生长因子」是一种人类体内皆有的多功能细胞激素,参与许多重要的生理过程,例如胚胎发育、细胞生长与分化、伤口愈合、细胞凋亡、血管新生及免疫调控等。是一种具有多功能的细胞激素,在人体内,众多类型的细胞皆具有产生并分泌此种细胞激素的能力。

TGFβ扮演抑制或促进疾病的双重角色,研究发现,癌症的发生与转移、失智症、动脉硬化、自体免疫疾病等疾病的病程演进,皆和TGFβ息息相关。

TGFβ在癌症扮演的角色依病程有所不同,在正常细胞(如上皮细胞)上,TGFβ能抑制细胞生长,当TGFβ功能降低或丧失时,都可能造成细胞异常增生。细胞异常增生是正常细胞变成癌细胞的必经之路;换句话说TGFβ作用是抑制癌症发生不可或缺的细胞激素。然而对已经癌化的细胞,TGFβ反而会促使癌细胞转移,使病程更加恶化,尤其在较为后期的肿瘤组织中,往往有大量的TGFβ表现。

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1. 研究摘要:

食用牛樟芝的硫酸化多醣体(SPS: Sulfated polysaccharides )已被鉴定为新型免疫调节剂。此研究通过进行一系列体外试验研究来评估牛樟芝硫化多醣SPS的抗癌作用。研究中发现,樟芝硫化多醣SPS诱导细胞周期停滞和激活caspase 3PARP抑制A549LLC1肺癌细胞株的生长。

对比之下,我们发现非硫化多醣(NSPS)不具抑制肺癌细胞的活性。此外,NSPS不会对A549和LLC1肺癌细胞造成细胞周期分布改变或启动凋亡相关分子。

转化生长因子β(TGFβ)TGFβ受体(TGFR的过度表达与肺癌肿瘤发生有关。牛樟芝硫化多醣SPS可抑制TGFβ诱导的细胞内信号传导,包括Smad2/3、FAK、Akt的磷酸化和细胞迁移。相比之下,非硫酸化多醣(NSPS)在A549和LLC1细胞中均未表现出相似的生物学功能。

从生理机制上,我们证明了樟芝硫化多醣SPS透过蛋白酶体依赖性降解途径来有效降低TGFR蛋白。本研究是首次确定SPS在引发TGFR降解与caspase 3PARP活化中扮演关键角色,从而抑制肺癌细胞的生存和迁移

 

2. 介绍

先前的研究显示,硫酸化多醣体具有多种生物活性,已被用于治疗各种疾病。例如,从褐藻中分离出一种硫酸化多醣,它具有抗血管生成,抗肿瘤和抗炎的活性。

牛樟芝是台湾独特的药用真菌/菇菌,经学者研究指出,牛樟芝具有免疫功能与多种生物活性,可促进身体健康并可用于治疗人类疾病。

近来,牛樟芝已被证明具有药理活性,例如抗肿瘤、保肝、抗氧化和免疫调节作用。例如,牛樟芝提取物已显示出抑制癌细胞增殖/存活并诱导细胞凋亡(癌细胞自杀)或细胞周期停滞(癌细胞增生停滞)以及抑制各种癌细胞的迁移/侵袭(癌细胞扩散)的潜力。更新的研究指出,通过牛樟芝乙醇提取物、多醣和顺铂的合并治疗,可以在细胞和动物模型中更有效的抑制小鼠肺癌的肿瘤发生。

在脂多醣(LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞产生发炎实验中,樟芝硫化多醣SPS的抗炎活性显示了对肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)有抑制释放的作用。

我们先前的研究发现,SPS增强了阿霉素对各种人类肿瘤细胞的细胞毒性(包括乳腺癌,肺癌和结肠癌细胞) [1];在我们目前的研究中,我们仔细分析了SPS抑制肿瘤生长能力和造成肿瘤细胞凋亡的过程。

转化生长因子β1(TGFβ1)在癌的发生和转移上扮演重要角色[6]。在肺癌晚期,TGFβ1细胞激素过度分泌被认为会促进肿瘤进展并加速造成癌细胞转移[7]。这些TGFβ经细胞内信号传导而促成基因表现,会促进包括人类肺腺癌在内的各种癌细胞的肿瘤进展、迁移和转移[2-5]

UPP (ubiquitin-proteasome pathway) 为一主要的蛋白质分解系统。此路径不但负责一些短生命期及长生命期蛋白质的分解,对于一些肿瘤抑制因子、转录因子及细胞周期的调控蛋白亦具同样作用。改变这些蛋白质的分解,对于肿瘤的生长及细胞凋亡有着深远的影响。UPP参与了TGFβ信号网络的负向调控。研究指出通过促进TGFR降解来阻断TGFR介导的信号是一种新的癌症治疗策略。

本研究证明,樟芝硫化多醣SPS不仅抑制肺癌细胞的生存力,而且还降低TGFR的蛋白表现并阻断TGFR调控的细胞内信号通路。樟芝硫化多醣SPS在促进TGFR降解以及诱导肺癌细胞停滞和凋亡中应具关键角色。 因此,SPS可用作抑制肺肿瘤发生的潜在膳食补充剂。

 

3. 结果与讨论:

3.1 SPS抑制人类A549肺癌细胞和小鼠LLC1肺癌细胞的增生

对A549和LLC1肺癌细胞进行一系列不同SPS(樟芝硫化多醣)浓度与时间处理,再对细胞生长进行分析。如图2A和B所示,MTT分析显示,A549和LLC1肺癌细胞分别在浓度400和800 ug / ml 的SPS处理72小时后,与对照组相比, 樟芝硫化多醣SPS对A549和LLC1肺癌细胞的生长抑制约为15-22%和25-32%

圖2 :SPS与NSPS抑制细胞存活性测试

 

3.2 SPS诱导G2期细胞周期阻滞和体外凋亡相关反应

我们进一步分析了樟芝硫化多醣SPS对A549和LLC1癌细胞的细胞周期的影响。我们发现,与未经处理的对照细胞相比,SPS处理(400mg / ml,持续48h),在sub-G1阶段A549癌细胞从1.3%增加到3.7%;LLC1癌细胞从2.9%增加到3.2%(图3A)。SPSG2 / M阶段造成A549癌细胞从14.2%增加到18.0%;LLC1癌细胞从18.0%增加到22.4%(图3A。这些结果表明,SPS可诱导肺癌细胞凋亡和细胞周期停滞。但是,NSPS不会诱导细胞周期分布的变化

接下来,我们研究了SPS诱导A549和LLC1细胞凋亡的相关机制。通过西方墨点法分析,樟芝硫化多醣SPS(400mg / ml)显著造成促凋亡蛋白caspase-3的活化,且具时间相关性(时间越长效果越显著) (图3B)。我们还发现,在处理48小时后,SPS剂量相关性地诱导了A549和LLC1细胞中caspase-3、ADP-ribose与PARP的活化(图3C)。

圖3 :SPS诱导细胞周期停滞并促进A549和LLC1细胞的凋亡

 

3.3 SPS在肺癌细胞中抑制TGFR信号分子活性和癌细胞迁移

TGFβ1介导的细胞内途径,包括Smad途径(Smad2 / 3)和非Smad途径分子(例如Akt和FAK),在肿瘤进展和肺癌转移中扮演至关重要的作用[6,7]。 本研究检查了SPS是否抑制Smad和非Smad途径的活性。如图4A所示,我们发现SPS以剂量相关性方式降低了A549LLC1肺癌细胞中Smad 2/3的磷酸化。我们还发现,与对照细胞相比,在处理2448小时后,SPS降低了癌细胞AKTpAKT)和FAKpFAK)的磷酸化(图4B4C)。

我们发现,SPS降低了A549细胞中TGFβ 1诱导的Smad 2/3、AKT和FAK的磷酸化(图4E)。由于已知FAK参与癌细胞迁移和侵袭,因此我们进一步研究了SPS对细胞迁移的影响。我们发现,与对照组细胞相比,SPS分别在有和没有TGFβ参与下抑制A549细胞的迁移约25%与 40%(图4F)。

综合以上,这些数据表明, 透过TGFβ1参与的细胞内传递路径造成肺癌细胞凋亡,进而表现出SPS对肺癌细胞的生存力和迁移的抑制效果。

圖4 :SPS抑制TGFR介导的Smad和非Smad依赖性信号分子,并抑制TGFβ1刺激的细胞迁移

 

3.4 SPS造成蛋白酶体相依的TGFR降解

如图5A-C所示,透过西方墨点和流式细胞分析法,樟芝硫化多醣SPS以剂量相关的方式迅速下调了肺癌细胞中TGFRI和TGFRII蛋白的表现(相较于未经SPS处理)。此外,我们发现SPS处理48小时显著下调了TGFRs的表达(图5D)。综上所述,这些结果表明SPS在抑制TGFR表现上扮演重要关键作用。

先前研究指出,UPP可加速降TGFR [8]。接下来,我们调查了SPS诱导的TGFR降解是否依赖于UPP介导的降解。一如预期,经SPS200 ug / ml)处理过后,分别导致A549LLC1肺癌细胞的TGFRI蛋白程度降低40%和50%(图6B)。与单独用SPS处理的细胞相比,在细胞中添加蛋白酶体抑制剂MG-132可以帮助SPS诱导的TGFRs蛋白质降解(图6B)。

综合上述研究表明,SPS在加速肺癌细胞中TGFR降解方面具有独特的功效与存活。

圖5 : SPS抑制TGFRI和TGFR I​​I表达

 

圖6 :SPS诱导蛋白酶体媒介的TGFR降解

 

4. 结论:

我们发现樟芝硫化多醣SPS抑制癌细胞生存和迁移的机制之一取决于在肺癌细胞中促进蛋白酶体媒介的TGFRs降解并同时抑制TGFR介导的Smad和非Smad信号通路。 我们首先证明SPS可通过诱导细胞周期停滞和凋亡相关反应来直接调节细胞生存,而NPSP不具有抗肿瘤活性。本研究发现SPS在下调TGFR与抑制肿瘤进展中具有关键作用。因此,樟芝硫化多醣SPS极具潜力可以作为饮食补充或治疗手段来抑制肺癌细胞生长。

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參考文獻:

  1. J. Cheng, C.C. Chang, C.H. Chao, M.K. Lu, Characterization of fungal sulfated polysaccharides and their synergistic anticancer effects with doxorubicin, Carbohydr. Polym. 90 (2012) 134-139.
  2. N. Tang, W.Q. Ding, X J. Guo, X.W. Yuan, et al,, Epigenetic regulation of Smad2 and Smad3 by proflin-2 promotes lung cancer growth and metastasis, Nat. Commun. 6 (2015) 8230.
  3. F. Vazquez, M.j. Carlini, M.C. Daroqui, L. Colombo, et al., TGF-beta specifically enhances the metastatic attributes of murine lung adenoca rcinoma: implications for human non-small cell lung cancer, Clin. Exp. Metastasis 30 (2013) 993-1007.
  4. L. Welm, TGFbeta primes breast tumor cells for metastasis, Cell 133 (2008) 27-28.
  5. C. Xu, L.M. Wu, W. Sun, N. Zhang, et al., Effects of TGF-beta signaling blockade on human A549 lung adenocarcinoma cell lines, Mol. Med. Rep. 4 (2011) 1007-1015.
  6. Dumont, C.L. Arteaga, Targeting the TGF beta signaling network in human neoplasia, Cancer Cell 3 (2003) 531-536.
  7. Sterlacci, D. Wolf, S. Savic, W. Hilbe, et al., High transforming growth factor beta expression represents an important prognostic parameter for surgically resected non-small cell lung cancer, Hum. Pathol. 43 (2012) 339-349.
  8. Izzi, L. Attisano, Regulation of the TGFbeta signalling pathway by ubiquitin-mediated degradation, Oncogene 23 (2004) 2071-2078.

NiuChangChih牛樟芝功效 (pharmacological effects of Antrodia cinnamomea)

保護肝臟(hepato-protective)、解酒(anti-hangover)、抗癌(anti-cancer)、抗過敏(anti-allergenic)、增強免疫力(strengthen immune system)、降高血壓(antihypertensive)、降高脂血(antihyperlipemic)、降血糖(anti-diabetic)、免疫調節(immunomodulatory)、抗氧化(anti-oxidant)、抗發炎(anti-inflammatory)

NiuChangChih牛樟芝的主要成份 (bioactive components of Antrodia cinnamomea)

三萜類(Triterpenoids)、多醣體(Polysaccharides)、腺苷(Adenosine)、超氧歧化酶(SOD)、麥角固醇(Ergosterol)、羊毛固醇(Lanosterol)、免疫蛋白(Immunity Protein)、維生素(Vitamins)、核酸(Nucleic Acid)、胺基酸(Amino Acid)、苯類(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinone derivates )、馬來酸(Maleic acid)琥珀酸(Succinic acid)、凝集素(Lectin)、木質素(Lignin)、血壓穩定物質(Antrodia acid)、礦物質(鈣、磷、鐵、鍺等)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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