【抗肺癌2】牛樟芝萃取物透过MAPK与PI3K/AKT机制抑制人类肺腺癌转移 Antrodia cinnamomea exhibit anti-migration action in lung adenocarcinoma through MAPK & PI3K/AKT
论文发表在荷兰期刊: Phytomedicine (植物医学)
肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，癌细胞转移是造成病患死亡的首要原因。癌细胞因增殖快速，需要足够的营养和氧气，因此，必须侵蚀周围正常细胞并要求新生血管来提供癌细胞增长所需条件，更可能经由血液和淋巴系统扩散至其他组织器官，即所谓的转移，这是造成罹癌患者的主要征候，也是临床治疗中最难以根治与死亡的主要原因。
本篇为您介绍的牛樟芝研究是中国医、中国医附设医院吴院长领军与兴大、成大共同研究，并获荷兰Phytomedicine (植物医学期刊)选用于2012年发表。研究发现牛樟芝萃取物可抑制MMP-2、MMP-9的活性进而达成抑制肺腺癌细胞转移。研究接着更进一步从生化机制去证实牛樟芝萃取物藉由MAPK与PI3K/AKT机制抑制癌细胞转移。学者投入牛樟芝研究已超过十多年，逐步厘清牛樟芝抗癌效果与机制，发表在各领域专业期刊已累积超过300篇。
科普一下甚么是蛋白酶? 蛋白酶是生物体内的一类酶（酵素），它们能够分解蛋白质。
那MMP-2与MMP-9又是甚么? MMP-2与MMP-9同属于基质金属蛋白酶(MMP: Matrix metallopoateinase)家族的一份子。基质金属蛋白酶 (MMP) 可以分解细胞外基质的结构蛋白，具有型态生成、血管生成、神经生成及细胞修复等组织重塑的能力 ; 但这能力也会促使癌细胞的增殖、迁移、分化、血管新生、及抑制细胞凋亡等作用。也就是说MMP与癌细胞的转移和侵袭有关系!!
MMP(基质金属蛋白酶)是一个大家族，在这么多种MMP成员中，属于明胶酶的MMP-2与MMP-9被认为与癌的转移及血管生成特别具有相关性，过量表现的MMP-2和MMP-9也会促使癌细胞的生长、血管新生、侵袭及恶化，帮助癌细胞向外扩散。
1.摘要：
癌症转移是癌症死亡的主要原因。台湾药用牛樟芝（Antrodia cinnamomea）已被证明具有抗氧化和抗癌活性。在本篇研究中，我们首先观察到在对正常细胞不具有毒性的情况下，牛樟芝子实体的乙醇萃取物（EEAC）对人体肺腺癌CL1-0细胞的转移和运动性具有浓度依赖性的抑制作用(浓度越高抑制效果越好)。
明胶酶谱测定(gelatin zymography)结果显示牛樟芝萃取物在抑制MMP-2、MMP-9（基质金属蛋白酶）的活性上具有浓度依赖性。蛋白质西方点墨法测定(Western blot)的结果显示，牛樟芝萃取物处理可降低MMP-9和MMP-2的表现。
牛樟芝萃取物（EEAC）里的两种主要化合物: 虫草素(codycepin)和三萜类樟菇酸A(zhankuic acid A)可单独或共同抑制MMP-9和MMP-2的表现。进一步研究发现，牛樟芝抑制了p38和JNK1/2的磷酸化。 牛樟芝还抑制PI3K的表现和AKT的磷酸化。这是第一份研究证实牛樟芝对人类肺腺癌细胞CL1-0具有抗转移作用。
2.结果与讨论：
2.1 牛樟芝萃取物(EEAC)对于人类肺腺癌CL1-0癌细胞的毒杀性分析
藉由MTT分析来测定不同浓度EEAC（0–128 μg/ml）对癌细胞活性的影响效果。 经培育24小时和36小时后，与未使用牛樟芝EEAC的控制组相比，低浓度EEAC（0.125–2 μg/ml）对癌细胞活力没有显著影响（图2），这表明EEAC在低浓度下对CL1-0癌细胞无毒。癌细胞在使用高浓度EEAC (4.0–128 μg/ml) 24和36小时后，癌细胞活力出现显著下降。 为了避免在接下来的实验中抑制癌细胞活力， EEAC的浓度我们仅使用0.125–1.0 μg/ml区间，培育时间则为36 小时。
圖2
2.2 牛樟芝萃取物(EEAC)对CL1-0癌细胞迁移能力的测定(wound scratch assay)
使用wound scratch assay分析去评估EEAC对CL1-0癌细胞迁移的影响(图3A)。培育36小时后，牛樟芝EEAC以剂量依赖性方式抑制CL1-0癌细胞的迁移能力，浓度0.5μg/ml抑制10.3％迁移力，浓度1.0 μg/ml抑制14.8％迁移力（图3B）。
圖3
2.3 牛樟芝萃取物(EEAC)对CL1-0癌细胞迁移的影响（体外测试）
使用Transwell测定法来分析CL1-0癌细胞在使用了EEAC 24小时后的迁移情况。研究发现添加0.25–1.0 μg/ml 牛樟芝EEAC可显著降低CL1-0癌细胞的23%迁移力（图4A,4B），且EEAC的抑制效果是具有剂量依赖性的(浓度越高抑制效果越好)。
圖4
2.4 牛樟芝萃取物(EEAC)抑制CL1-0细胞中MMP-2和MMP-9的活性
为了检查EEAC可能的抗迁移机制，我们透过明胶酶谱分析去评估CL1-0癌细胞中MMP-2和MMP-9的活性。 在没有使用牛樟芝EEAC的情况下，CL1-0癌细胞分泌高程度的MMP-9和MMP-2。 如图5所示，牛樟芝EEAC以浓度依赖性方式抑制MMP-9和MMP-2活性（图5A,5B）。 MMP-2和MMP-9被认为会促使癌细胞生长、血管新生、帮助癌细胞向外扩散。研究结果表明，牛樟芝EEAC能抑制MMP-9和MMP-2活性而达成抑制CL1-0肺癌细胞迁移。
圖5
2.5 牛樟芝萃取物(EEAC)对MMP-2和MMP-9的抑制性
为了检查牛樟芝EEAC可能的抗迁移机制，我们透过蛋白质西方点墨法分析去评估CL1-0癌细胞中MMP-2和MMP-9的表现。 在没有EEAC处理的情况下，CL1-0癌细胞有高程度的MMP-9和MMP-2表现。 如图6A所示，EEAC以浓度依赖性方式抑制MMP-9和MMP-2的表现。
圖6
2.6 牛樟芝萃取物(EEAC)中主成分虫草素、樟菇酸A对MMP-2和MMP-9抑制性
牛樟芝萃取物(EEAC)中有两项主成分: 虫草素与樟菇酸A。为了检查虫草素、樟菇酸A可能的抗迁移机制，我们透过蛋白质西方点墨法分析去评估CL1-0癌细胞中MMP-2和MMP-9的表现。在没有使用牛樟芝EEAC的情况下，CL1-0细胞表现出高程度的MMP-9和MMP-2。 如图6B所示，单独使用虫草素、樟菇酸A或同时使用虫草素+樟菇酸，都可抑制MMP-9和MMP-2的表现。
2.7 牛樟芝萃取物(EEAC)对CL1-0癌细胞的PI3K、AKT、磷酸化AKT（pAKT）和Rac-1表现的影响
PI3K是一组分布甚广的脂质激酶，在细胞信号传导的主要途径中扮演重要作用。
各类型细胞在进行细胞增殖、分化和死亡过程中，PI3K / AKT扮演重要调节功能。
为了进一步研究PI3K / AKT的影响，进行了一系列实验评估经牛樟芝EEAC刺激后传讯分子的表现。 结果显示，CL1-0癌细胞与牛樟芝EEAC（0.125–1.0 μg/ml）培养后，剂量依赖性地导致降低PI3K和pAKT（图7），进而影响癌细胞信号传递。 但是，EEAC（0–1.0μ g/ml，36小时）对Rac-1蛋白表现没有影响（图7）。
圖7
2.8 牛樟芝萃取物(EEAC)对CL1-0癌细胞的FAK, ERK1/2, p38 和 JNK1/2磷酸化表现的影响
为了评估EEAC对FAK和pFAK蛋白表现的影响，将CL1-0细胞使用不同浓度的EEAC (0、0.125、0.25、0.5和1.0 g/ml) 各36小时。 如图8所示，当EEAC浓度高于0.5μg/ml时，EEAC显著抑制CL1-0细胞中的pFAK表现。
将CL1-0细胞在使用EEAC（0.125–1.0 g/ml）36小时后，进行MAPK磷酸化分析。图8中的数据表明EEAC在0.125至1.0 g/ml的浓度下显著剂量依赖性地影响pFAK，p-JNK1/2和p-p38蛋白表现。
圖8
3.结论：
研究显示，牛樟芝萃取物(EEAC)显著抑制了CL1-0细胞的迁移（使用Transwell测定法和wound scratch assay测定法评估）（图3和4）。 牛樟芝EEAC显著抑制MMP-2和MMP-9的活性（图5）。研究结果表明，牛樟芝EEAC能抑制MMP-9和MMP-2活性而达成抗CL1-0肺癌细胞与抑制迁移。 这是首次从生化机制证明牛樟芝EEAC抑制了人类肺腺癌CL1-0细胞迁移能力。
从机制上来说，EEAC抑制效果的发生是透过让p-38与JNK1/2信号通路失去作用+抑制FAK和p-FAK蛋白表现+抑制PI3K和磷酸化AKT，从而降低了CL1-0癌细胞中MMP-2，MMP-9的活性表现（图9）。 未来相关研究可能需要进一步的临床研究来证明牛樟芝EEAC作为抗癌药的潜力。
圖9 本篇研究推论EEAC介导抑制CL1-0细胞迁移的信号通路。 EEAC的作用可能是通过抑制FAK来实现的，FAK可以通过MAPK和PI3K / AKT信号通路调节MMP9的表现。
NiuChangChih牛樟芝功效 (pharmacological effects of Antrodia cinnamomea)：
保护肝脏(hepato-protective)、解酒(anti-hangover)、抗癌(anti-cancer)、抗过敏(anti-allergenic)、增强免疫力(strengthen immune system)、降高血压(antihypertensive)、降高脂血(antihyperlipemic)、降血糖(anti-diabetic)、免疫调节(immunomodulatory)、抗氧化(anti-oxidant)、抗发炎(anti-inflammatory)
NiuChangChih牛樟芝的主要成份 (bioactive components of Antrodia cinnamomea)：
三萜类（Triterpenoids）、多醣体（Polysaccharides）、腺苷（Adenosine）、超氧歧化酶（SOD）、麦角固醇（Ergosterol）、羊毛固醇（Lanosterol）、免疫蛋白（Immunity Protein）、维生素（Vitamins）、核酸（Nucleic Acid）、胺基酸（Amino Acid）、苯类(benzenoids)、苯醌衍生物(benzoquinone derivates )、马来酸（Maleic acid）琥珀酸（Succinic acid）、凝集素（Lectin）、木质素（Lignin）、血压稳定物质（Antrodia acid）、矿物质（钙、磷、铁、锗等）
