【抗大肠癌2】台湾牛樟芝酒精萃取物增强两性霉素B细胞毒性研究Ethanolic Extract of Antrodia camphorata Enhances the Cytotoxic Effects of AmB
论文发表在美国期刊: Agricultural and Food Chemistry (美国食品化学与农业期刊)
在国内学者努力下，民间口耳相传的抗癌神秘效果，透过科学研正一层层的剥开其神秘面纱，找出有效的抗癌成分与作用的机制。本篇为您介绍的牛樟芝研究是台北医学大学教授、北医大附设医院医师与三军总医院血液肿瘤科医师等共同完成的研究，并获美国食品化学与农业期刊选用与2011年发表。
本篇研究独特之处在于以牛樟芝萃取物（TCEE）为钥匙，在癌细胞的细胞膜开启孔洞，让能毒杀癌细胞的药物AmB (两性霉素B)进入癌细胞内，进而令癌细胞凋亡(死亡) 增加。另外TCEE与AmB的合并治疗同时也可以有效抑制癌细胞株生长，使大肠癌细胞株停留于 G2/M 期，在动物实验中发现其体内肿瘤生长显著减少了93％，6只小鼠中有2只的肿瘤完全消失。也就是透过TCEE与AmB的合并治疗发挥了令人印象深刻的抗癌效果。
本实验选取牛樟芝萃取物（TCEE）与两性霉素 B (AmB)合并治疗模式来增强抗癌效果，利用樟芝萃取物的三萜类可以转换成酯醇的特性，从三萜类中再筛选出对于两性霉素 B 具有较佳亲和力之成分，再以此特定三萜酯醇去取代癌细胞膜的胆固醇，进而影响细胞膜之通透性，提高两性霉素 B毒杀癌细胞的作用，造成癌细胞裂解而死亡。也就是两性霉素 B 可以与樟芝萃取物达到最佳协同作用的抑制能力，成为一种治疗癌症的复合疗法。
1.摘要：
台湾牛樟芝（Antrodia cinnamomea, Taiwanofungus camphoratus）是一种在台湾使用的著名汉草药，具有多种药理功能，包括抗癌作用。
牛樟芝乙醇萃取物（TCEE）和两性霉素B（AmB）各自对HT29(人类大肠癌细胞株)细胞中均显示出明显细胞毒性可毒杀癌细胞，且具有剂量关联性(浓度越高效果越好)。
在本研究中，我们旨在研究一种新的抗癌作用，方法是用牛樟芝乙醇萃取物（TCEE）预先与癌细胞共培养，然后再施用抗真菌剂两性霉素B（AmB）。HT29癌细胞经的TCEE预培养后，可增强AmB对HT29癌细胞的细胞毒性，经TCEE和AmB治疗后的癌细胞发现显著的细胞凋亡效果。 在动物实验中，AmB加TCEE的合并治疗更可显著抑制HT29肿瘤的生长。
总体而言，研究结果显示与AmB和TCEE合并治疗可有效诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长。将来，TCEE可能会成为治疗结直肠癌患者的潜力补充品和替代药物。
2.结果与讨论：
2.1 AmB与TCEE对HT29癌细胞的细胞毒性
如图1 A,B所示，牛樟芝萃取物（TCEE）与两性霉素 B (AmB)个别均可抑制HT29肿瘤细胞的增殖且具有剂量关联性。
接着在AmB和TCEE合并治疗的研究上，设计了两种不同的合并治疗方案（co-treat:共治疗和pretreat:预培养）以评估AmB加TCEE的效果。 使用剂量TCEE为 50μg/ mL；AmB 则分为 0, 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 μM 连续施予24小时。
图1 C,D所示TCEE与AmB共治疗(co-trreat)仅具有轻微的抗增殖作用，但TCEE预培养(pretreat)则显著增强了AmB的对癌细胞毒性。相较于图1 A,B 单独使用AmB或TCEE，AmB加TCEE预培养对于抑制癌细胞之生长有明显抑制效果。
注:
pretreat: 预培养 组别中先将细胞株以TCEE处理 24 小时，再搭配AmB
co-treat: 共培养 组别中则是同时加入TCEE与AmB
MTT分析: 细胞存活率分析
圖1
2.2藉由AmB与TCEE合并治疗可造成HT29癌细胞凋亡。
许多文献指出利用其他固醇(sterol)以取代癌细胞膜上的胆固醇，提高其对于多烯类之抗真菌药物如两性霉素 B (AmB)的亲和力，达到毒杀作用。推测癌细胞较正常细胞代谢速率快，因此细胞膜的生合成更加快速，外来的固醇类更容易嵌入细胞膜，透过其与两性霉素 B (AmB)的亲和力，增加AmB在癌细胞膜上通透性，达到杀死癌细胞(凋亡)而不影响正常细胞之结果。
进一步针对牛樟芝萃取物（TCEE）与两性霉素 B (AmB)合并治疗进行研究，确认是否也会诱导凋亡。 如图2A所示，针对HT29癌细胞使用AmB与TCEE合并治疗，透过膜联蛋白V－碘化丙啶（PI）双重染色显影技术来检查HT29癌细胞的凋亡作用。图2B经AmB与TCEE合并治疗后HT29癌细胞的活力显著下降，且随AmB剂量增加出现细胞活力下降的剂量关联性。图2C，经AmB与TCEE合并治疗后HT29癌细胞的凋亡细胞百分比显著增加，且具剂量关联性。
圖2
2.3 TCEE对HT29癌细胞造成细胞周期阻滞。
牛樟芝萃取物（TCEE）与两性霉素 B (AmB)联合治疗可造成癌细胞凋亡外，本研究进一步检查AmB与TCEE是否造成癌细胞的细胞周期阻滞，影响癌细胞分裂进程，找出造成抗癌作用发生的机制，我们使用流式细胞仪研究了TCEE在调节细胞周期进程中的作用。 HT29细胞用TCEE预处理24小时，然后用AmB处理0、6、12、18或24小时后，可导致G2 / M期细胞百分比显著增加。 TCEE引起的G2 / M细胞周期阻滞最早发生在治疗后6小时。先前的研究人员表明，cdc2与细胞周期蛋白B1结合形成Mphase促进因子（MPF），从而诱导有丝分裂。在我们的研究中，与对照组相比，该治疗导致HT29细胞中细胞周期蛋白B1的减少(图4C)。出乎意料的是，CDK2的蛋白质水平在与4.5μM AmB和50μg/ mL TCEE合并治疗后增加(图4C)。尽管AmB和TCEE对凋亡途径有影响，但结果表明，AmB和TCEE的合并治疗也影响G2 / M期相关蛋白的表达，进而导致细胞周期阻滞。
注:
细胞增生所经过的细胞周期分为G1期(DNA合成前期)→S期(DNA合成期)→G2期(DNA合成后期)→M期(有丝分裂期) ，癌细胞也会经过一样的程序进行增生。
圖4
2.4 TCEE和AmB对裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用。
因为牛樟芝萃取物（TCEE）与两性霉素 B (AmB)在体外HT29细胞实验中对癌细胞毒杀性与抑制癌细胞生长上极具潜力。本研究进一步探讨它们在小鼠异种移植肿瘤动物实验中的治疗效果。
在HT29大肠癌裸鼠肿瘤生长的实验中评估TCEE和AmB合并治疗的效果。 实验中使用了了两种不同的组合方案。 在第一种方法中，每天给小鼠饲喂10 mg / kg TCEE，持续2周，然后每天注射AmB（100μg/ kg），持续2周。 在这些条件下，从体重变化程度轻微显示这些药物毒性是轻微的。 在HT29大肠癌裸鼠肿瘤生长实验中，采用TCEE和AmB合并治疗显著的让癌肿瘤缩小（图5 B,C； P <0.01），相较于单独使用AmB或TCEE的对照组效果显著。实验结果证明TCEE增强了AmB在体内的抗肿瘤作用。
圖5
接下来，我们研究了更紧凑的短期治疗方案是否会进一步提高AmB / TCEE组合的疗效。 每天给小鼠喂10 mg / kg TCEE，持续2天，然后在第三天注射AmB（100μg/ kg）。 重复此处理10个周期（总共30天）。
体重方面没有显著变化（图6A），而用AmB和TCEE组合治疗的小鼠肿瘤生长减少了93％（图6B； P <0.01）。
TCEE和AmB的组合显著抑制了大肠癌裸鼠肿瘤生长的实验中HT29细胞的生长（图6C）。 值得注意的是，6只小鼠中有2只的肿瘤完全消失（图6D）。 结果显示，TCEE和AmB的新型组合具有有效的抗肿瘤治疗功效，且毒性相对较小。
圖6
结论：
牛樟芝萃取物（TCEE）与两性霉素 B (AmB)合并治疗的抗癌效果非常显著，推测是透过诱导细胞周期停滞与造成细胞凋亡而达成。 这些作用发生的机制可能是由某些关键细胞周期和凋亡调节蛋白水平的改变引起的。 我们的结果表明，AmB和TCEE合并治疗具有治疗大肠癌患者的临床潜力，可以作为潜力替代药物或组合治疗使用。
