【抗大腸癌2】台灣牛樟芝酒精萃取物增強兩性黴素B細胞毒性研究Ethanolic Extract of Antrodia camphorata Enhances the Cytotoxic Effects of AmB
論文發表在美國期刊: Agricultural and Food Chemistry (美國食品化學與農業期刊)
在國內學者努力下，民間口耳相傳的抗癌神秘效果，透過科學研正一層層的剝開其神秘面紗，找出有效的抗癌成分與作用的機制。本篇為您介紹的牛樟芝研究是臺北醫學大學教授、北醫大附設醫院醫師與三軍總醫院血液腫瘤科醫師等共同完成的研究，並獲美國食品化學與農業期刊選用與2011年發表。
本篇研究獨特之處在於以牛樟芝萃取物（TCEE）為鑰匙，在癌細胞的細胞膜開啟孔洞，讓能毒殺癌細胞的藥物AmB (兩性黴素B)進入癌細胞內，進而令癌細胞凋亡(死亡) 增加。另外TCEE與AmB的合並治療同時也可以有效抑制癌細胞株生長，使大腸癌細胞株停留於 G2/M 期，在動物實驗中發現其體內腫瘤生長顯著減少了93％，6只小鼠中有2只的腫瘤完全消失。也就是透過TCEE與AmB的合並治療發揮了令人印象深刻的抗癌效果。
本實驗選取牛樟芝萃取物（TCEE）與兩性黴素 B (AmB)合並治療模式來增強抗癌效果，利用樟芝萃取物的三萜類可以轉換成酯醇的特性，從三萜類中再篩選出對於兩性黴素 B 具有較佳親和力之成分，再以此特定三萜酯醇去取代癌細胞膜的膽固醇，進而影響細胞膜之通透性，提高兩性黴素 B毒殺癌細胞的作用，造成癌細胞裂解而死亡。也就是兩性黴素 B 可以與樟芝萃取物達到最佳協同作用的抑制能力，成為一種治療癌症的復合療法。
1.摘要：
台灣牛樟芝（Antrodia cinnamomea, Taiwanofungus camphoratus）是一種在台灣使用的著名漢草藥，具有多種藥理功能，包括抗癌作用。
牛樟芝乙醇萃取物（TCEE）和兩性黴素B（AmB）各自對HT29(人類大腸癌細胞株)細胞中均顯示出明顯細胞毒性可毒殺癌細胞，且具有劑量關聯性(濃度越高效果越好)。
在本研究中，我們旨在研究一種新的抗癌作用，方法是用牛樟芝乙醇萃取物（TCEE）預先與癌細胞共培養，然後再施用抗真菌劑兩性黴素B（AmB）。HT29癌細胞經的TCEE預培養後，可增強AmB對HT29癌細胞的細胞毒性，經TCEE和AmB治療後的癌細胞發現顯著的細胞凋亡效果。 在動物實驗中，AmB加TCEE的合並治療更可顯著抑制HT29腫瘤的生長。
總體而言，研究結果顯示與AmB和TCEE合並治療可有效誘導細胞凋亡並抑制腫瘤生長。將來，TCEE可能會成為治療結直腸癌患者的潛力補充品和替代藥物。
2.結果與討論：
2.1 AmB與TCEE對HT29癌細胞的細胞毒性
如圖1 A,B所示，牛樟芝萃取物（TCEE）與兩性黴素 B (AmB)個別均可抑制HT29腫瘤細胞的增殖且具有劑量關聯性。
接著在AmB和TCEE合並治療的研究上，設計了兩種不同的合並治療方案（co-treat:共治療和pretreat:預培養）以評估AmB加TCEE的效果。 使用劑量TCEE為 50μg/ mL；AmB 則分為 0, 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 μM 連續施予24小時。
圖1 C,D所示TCEE與AmB共治療(co-trreat)僅具有輕微的抗增殖作用，但TCEE預培養(pretreat)則顯著增強了AmB的對癌細胞毒性。相較於圖1 A,B 單獨使用AmB或TCEE，AmB加TCEE預培養對於抑制癌細胞之生長有明顯抑制效果。
註:
pretreat: 預培養 組別中先將細胞株以TCEE處理 24 小時，再搭配AmB
co-treat: 共培養 組別中則是同時加入TCEE與AmB
MTT分析: 細胞存活率分析
圖1
2.2藉由AmB與TCEE合並治療可造成HT29癌細胞凋亡。
許多文獻指出利用其他固醇(sterol)以取代癌細胞膜上的膽固醇，提高其對於多烯類之抗真菌藥物如兩性黴素 B (AmB)的親和力，達到毒殺作用。推測癌細胞較正常細胞代謝速率快，因此細胞膜的生合成更加快速，外來的固醇類更容易嵌入細胞膜，透過其與兩性黴素 B (AmB)的親和力，增加AmB在癌細胞膜上通透性，達到殺死癌細胞(凋亡)而不影響正常細胞之結果。
進一步針對牛樟芝萃取物（TCEE）與兩性黴素 B (AmB)合並治療進行研究，確認是否也會誘導凋亡。 如圖2A所示，針對HT29癌細胞使用AmB與TCEE合並治療，透過膜聯蛋白V－碘化丙啶（PI）雙重染色顯影技術來檢查HT29癌細胞的凋亡作用。圖2B經AmB與TCEE合並治療後HT29癌細胞的活力顯著下降，且隨AmB劑量增加出現細胞活力下降的劑量關聯性。圖2C，經AmB與TCEE合並治療後HT29癌細胞的凋亡細胞百分比顯著增加，且具劑量關聯性。
圖2
2.3 TCEE對HT29癌細胞造成細胞周期阻滯。
牛樟芝萃取物（TCEE）與兩性黴素 B (AmB)聯合治療可造成癌細胞凋亡外，本研究進一步檢查AmB與TCEE是否造成癌細胞的細胞周期阻滯，影響癌細胞分裂進程，找出造成抗癌作用發生的機制，我們使用流式細胞儀研究了TCEE在調節細胞周期進程中的作用。 HT29細胞用TCEE預處理24小時，然後用AmB處理0、6、12、18或24小時後，可導致G2 / M期細胞百分比顯著增加。 TCEE引起的G2 / M細胞周期阻滯最早發生在治療後6小時。先前的研究人員表明，cdc2與細胞周期蛋白B1結合形成Mphase促進因數（MPF），從而誘導有絲分裂。在我們的研究中，與對照組相比，該治療導致HT29細胞中細胞周期蛋白B1的減少(圖4C)。出乎意料的是，CDK2的蛋白質水平在與4.5μM AmB和50μg/ mL TCEE合並治療後增加(圖4C)。盡管AmB和TCEE對凋亡途徑有影響，但結果表明，AmB和TCEE的合並治療也影響G2 / M期相關蛋白的表達，進而導致細胞周期阻滯。
註:
細胞增生所經過的細胞周期分為G1期(DNA合成前期)→S期(DNA合成期)→G2期(DNA合成後期)→M期(有絲分裂期) ，癌細胞也會經過一樣的程式進行增生。
圖4
2.4 TCEE和AmB對裸鼠異種移植腫瘤生長的抑製作用。
因為牛樟芝萃取物（TCEE）與兩性黴素 B (AmB)在體外HT29細胞實驗中對癌細胞毒殺性與抑制癌細胞生長上極具潛力。本研究進一步探討它們在小鼠異種移植腫瘤動物實驗中的治療效果。
在HT29大腸癌裸鼠腫瘤生長的實驗中評估TCEE和AmB合並治療的效果。 實驗中使用了了兩種不同的組合方案。 在第一種方法中，每天給小鼠飼喂10 mg / kg TCEE，持續2周，然後每天註射AmB（100μg/ kg），持續2周。 在這些條件下，從體重變化程度輕微顯示這些藥物毒性是輕微的。 在HT29大腸癌裸鼠腫瘤生長實驗中，採用TCEE和AmB合並治療顯著的讓癌腫瘤縮小（圖5 B,C； P <0.01），相較於單獨使用AmB或TCEE的對照組效果顯著。實驗結果證明TCEE增強了AmB在體內的抗腫瘤作用。
圖5
接下來，我們研究了更緊湊的短期治療方案是否會進一步提高AmB / TCEE組合的療效。 每天給小鼠喂10 mg / kg TCEE，持續2天，然後在第三天註射AmB（100μg/ kg）。 重復此處理10個周期（總共30天）。
體重方面沒有顯著變化（圖6A），而用AmB和TCEE組合治療的小鼠腫瘤生長減少了93％（圖6B； P <0.01）。
TCEE和AmB的組合顯著抑制了大腸癌裸鼠腫瘤生長的實驗中HT29細胞的生長（圖6C）。 值得註意的是，6只小鼠中有2只的腫瘤完全消失（圖6D）。 結果顯示，TCEE和AmB的新型組合具有有效的抗腫瘤治療功效，且毒性相對較小。
圖6
結論：
牛樟芝萃取物（TCEE）與兩性黴素 B (AmB)合並治療的抗癌效果非常顯著，推測是透過誘導細胞周期停滯與造成細胞凋亡而達成。 這些作用發生的機制可能是由某些關鍵細胞周期和凋亡調節蛋白水平的改變引起的。 我們的結果表明，AmB和TCEE合並治療具有治療大腸癌患者的臨床潛力，可以作為潛力替代藥物或組合治療使用。
